Metilasi dan demetilasi DNA sebenarnya merupakan beberapa gelombang dalam anak sungai dari sungai panjang epigenetik, yang sekarang sedang berjalan lancar. Metilasi DNA adalah salah satu modifikasi epigenetik pertama yang ditemukan dan dikenali, dan melibatkan penambahan gugus metil (-CH3) ke atom karbon ke-5 dari cincin pirimidin dari basa sitidin (C). Modifikasi ini tidak terjadi pada semua C dari urutan DNA, tetapi terutama pada C yang terjadi bersamaan dengan CG (kemudian ditemukan: pada sel punca embrionik, banyak metilasi juga terjadi pada C lainnya). Jangan lihat modifikasi kecil ini, tetapi modifikasi ini menambahkan informasi tambahan pada DNA, sehingga memungkinkan keragaman informasi genetik yang kaya untuk diekspresikan dalam genom yang terbatas. Timbul pertanyaan, apa sebenarnya informasi tambahan ini? Pertama-tama, metilasi DNA secara sederhana dipahami sebagai ‘kunci’, di mana bagian DNA yang ditandai oleh metilasi DNA sebagian besar merupakan gen yang perlu ‘dibersihkan’ dan ‘dipenjara’, misalnya “Pembuat kerusakan” genom, transposon, dikendalikan oleh “kunci” metilasi, dan jika tidak terkendali atau tidak terkontrol dengan baik, “pembuat kerusakan” ini akan melompat-lompat di sekitar genom. Jika dibiarkan atau tidak diatur, “pembuat kerusakan” ini dapat melompat-lompat di dalam genom, mengacaukannya dan menyebabkan banyak masalah, seperti perkembangan tumor. Metilasi DNA paling konsisten dengan definisi pewarisan epigenetik; metilasi DNA sangat stabil dan dapat diwariskan pada tingkat somatik, yang berarti bahwa sel ‘anak’ yang dibentuk oleh pembelahan sel somatik tidak hanya mewarisi urutan DNA genom dari sel ‘induk’, tetapi juga Ini berarti bahwa sel ‘anak’ tidak hanya mewarisi urutan DNA genom dari sel ‘ibu’, tetapi juga menyalin pola metilasi DNA genom sel ‘ibu’ dengan sangat tepat. Namun, selama pembentukan sel germinal, dan juga selama diferensiasi sel telur yang telah dibuahi menjadi embrio, metilasi DNA genom mengalami ‘renovasi’ besar-besaran dalam waktu yang sangat singkat. Sebagai contoh, metilasi DNA genom sperma tampaknya ‘dibersihkan’ sebelum sel telur yang telah dibuahi membelah, dan mulai dibangun kembali dengan cepat segera setelah sel telur yang telah dibuahi membelah. Ada juga pembentukan ulang metilasi selama pembentukan sel germinal (sperma dan sel telur). Hal ini menimbulkan pertanyaan mendasar yang penting: bagaimana metilasi DNA ‘dibersihkan’ dalam waktu yang singkat? Kunci untuk menjawab pertanyaan ini adalah menemukan demetilase DNA yang dapat menghilangkan gugus metilasi dari DNA. Namun demikian, masalahnya mudah ditimbulkan, tetapi tidak mudah dipecahkan. Sudah lebih dari satu dekade sejak pertama kali diusulkan, tetapi masih belum terselesaikan! Alasannya adalah karena proses demetilasi DNA terbatas pada periode pasca-pembuahan sebelum pembelahan sel telur dan produksi sel germinal, dengan jendela waktu yang sangat singkat dan sumber sel yang terbatas untuk mendapatkan jumlah sel atau jaringan yang cukup untuk manipulasi biologi molekuler untuk mengidentifikasi gen, dan lebih sedikit lagi untuk manipulasi biokimiawi guna memurnikan enzim, sehingga sangat sulit untuk dipelajari. Proses demetilasi DNA ini telah menjadi misteri besar selama bertahun-tahun. Pertanyaannya penting, tetapi “anjing menggigit landak dan tidak ada cara untuk mendapatkannya”. Ada sebuah selingan. Seorang ahli biologi Kanada keturunan Yahudi, Profesor Szyf, membuat lelucon besar tentang metilasi DNA, tetapi dia keluar dari jalur dan berakhir sebagai ilmuwan alternatif, seorang tokoh marjinal di bidangnya. Laboratoriumnya menemukan enzim demetilasi DNA, yang dipublikasikan di Nature pada tahun 1999 dan menimbulkan sensasi di masyarakat, tetapi laboratorium lain tidak dapat menirunya. Studi tentang demetilasi DNA tetap tidak aktif selama beberapa tahun. Pada tahun 2005, penemuan demetilase histon dan mekanisme katalitik di laboratorium Shi Yang menimbulkan sensasi dan menginspirasi banyak orang untuk mencari dan mengidentifikasi demetilase DNA. Laboratorium Shang Yongfeng di Universitas Peking melaporkan “demetilasi DNA aktif” yang spesifik pada sel kanker ovarium, dan laboratorium Zhu Health di Amerika Serikat menemukan dan mengidentifikasi demetilasi DNA pada tanaman. Namun, metilesterase DNA mamalia masih “belum teridentifikasi” dan “tidak diketahui”. Pada tahun 2008, dua makalah yang diterbitkan di Nature oleh konsorsium laboratorium Jerman dan laboratorium Prancis melaporkan demetilasi DNA aktif terlokalisasi dalam sel pembawa. Pada titik ini, Bestor di Universitas Columbia, seorang sub-pemimpin di bidang metilasi DNA, keluar dan mengomentari cerita di Cell dengan nada sarkastik (Sejarah penuh warna demetilasi DNA aktif). Sebelumnya, ahli biologi perkembangan Niehrs dari Heidelberg melaporkan di Nature bahwa protein yang dapat menginduksi kerusakan DNA, Gadd45a, mendorong demetilasi DNA, tetapi segera mendapat bantahan. Laboratorium Pfeifer di Beckman Institute di California, Amerika Serikat, menerbitkan sebuah artikel di PLoS Genet yang menolak hasil penelitian Niehrs dengan judul: GADD45A tidak mendorong demetilasi DNA! Akan tetapi, beberapa laporan berikutnya dari laboratorium yang berbeda telah mengkonfirmasi hasil penelitian Niehrs. Namun demikian, masih ada beberapa masalah: 1) Gadd4a knockout tidak menghalangi perkembangan embrio dan tidak memengaruhi proses demetilasi sebelum pembuahan, 2) CADD4a sebenarnya bukanlah enzim demetilasi, ia hanya memulai mekanisme perbaikan DNA yang disebut perbaikan eksisi asam nukleat (nuclear acid excision repair/NER), yang terutama digunakan untuk memperbaiki kerusakan DNA yang disebabkan oleh sinar UV. Ini hanya memulai mekanisme perbaikan DNA yang disebut perbaikan eksisi asam nuklir (NER, terutama digunakan untuk memperbaiki kerusakan DNA yang disebabkan oleh sinar UV), yang memotong bagian DNA termetilasi dan mensintesis ulang untaian baru. Dapat dimengerti bahwa mekanisme ini bekerja pada demetilasi spesifik gen lokal atau individu, tetapi saya khawatir mekanisme ini tidak dapat diterima sebagai mekanisme umum yang terlibat dalam pemrograman ulang metilasi di seluruh genom. Sebagai analogi, jika Anda ingin mengubah warna dinding, apakah Anda lebih suka menghapus batu bata dari dinding dan menggantinya dengan yang baru, atau hanya menghapus cat temboknya saja? Terutama jika ini adalah perubahan besar untuk seluruh bangunan? Bagaimanapun juga, ini adalah masalah efisiensi di satu sisi dan ekonomi di sisi lain. Akhirnya, pada tahun 2009-2010, DNA demetilase menjadi pusat perhatian dan menjadi bintang baru yang bersinar. Penemuan dan identifikasi demetilase DNA mewakili dua model penelitian yang berbeda (dua model penelitian, dua setengah mekanisme, tujuh molekul). Berbasis hipotesis Ini adalah model klasik penelitian ilmiah, di mana hipotesis pertama-tama dirumuskan dan kemudian eksperimen dirancang untuk mengujinya. Hipotesis sering kali salah dan oleh karena itu merupakan strategi yang berisiko tinggi bagi kita secara umum. Keberhasilan dalam strategi ini tidak hanya membutuhkan intuisi, imajinasi, dan keberanian, tetapi juga pengalaman dan fondasi yang kuat, dan tentu saja keterampilan penalaran logis sangat penting. Mengapresiasi penelitian ilmiah tingkat tinggi terkadang sama menyenangkannya dengan membaca kasus-kasus detektif Sherlock Holmes. Dalam kasus penelitian demetilasi DNA, kita dapat mengapresiasi dua contoh penelitian yang digerakkan oleh hipotesis. Pertama, Anjana Rao, yang sebelumnya adalah seorang ahli imunologi di Departemen Patologi di Universitas Harvard, yang kini bekerja di La Jolla Institute for Metabolic Research di California, terpilih menjadi anggota American Academy of Sciences pada tahun 2008. Dia bukan berasal dari komunitas epigenetik, tetapi semua orang adalah semua orang, dan ketika mereka menyerang, mereka menyerang dengan hebat, sama seperti Shi Yang, yang awalnya tidak berspesialisasi dalam modifikasi metilasi histon, tetapi terinspirasi untuk masuk ke wilayah epigenetik dan masih membuat penemuan yang sangat penting. Gagasan Rao bahwa demetilasi DNA mungkin melalui mekanisme oksigenasi (hidroksilasi atau penambahan monooksigenasi) mungkin terinspirasi oleh penelitian terhadap organisme model, trypanosome Afrika. Di dalam trypanosom terdapat enzim, JBP1, yang menambahkan oksigen (hidroksilasi) ke gugus metil timin untuk membentuk gugus hidroksil, di mana enzim lain kemudian melekatkan gugus gula, sehingga membentuk struktur unik (dinamai struktur J) yang, meskipun tidak menghilangkan gugus metil asli, berperan dalam pengaturan ekspresi gen. Timin dan metilsitosin memiliki struktur yang sangat mirip (keduanya merupakan cincin pirimidin), dengan gugus metil pada posisi yang sama, dan Rao berhipotesis bahwa enzim dan mekanisme yang sama mungkin ada pada organisme yang lebih tinggi. Berdasarkan hipotesis ini, mereka melakukan beberapa putaran pencarian homologi melalui sekuens protein (PSI-blast) dan akhirnya menemukan tiga gen, Tet1, 2 dan 3, dalam database protein manusia dan murin. Gen-gen ini juga ditemukan lazim dalam filum postnatal, menunjukkan pentingnya dan konservasi mekanisme fungsional ini. Melalui analisis sitologi dan biokimia, mereka membuat dua temuan penting: 1. mereka mengkonfirmasi bahwa ketiga protein tersebut memiliki modifikasi sitosin termetilasi yang teroksigenasi, tetapi dengan intensitas aktivitas yang berbeda, yang seharusnya merupakan hasil yang diharapkan dari proyek mereka; 2. sitosin termetilasi dikatalisis oleh reaksi oksigenasi untuk membentuk bentuk modifikasi baru, hidroksil-metil-sitidin (hm-C). cytidine (hm-C), sebuah modifikasi yang memberikan sifat dan informasi epigenetik baru pada DNA; penemuan kedua ini secara tidak terduga tidak direncanakan dan mungkin memiliki implikasi yang lebih luas lagi. Segera setelah itu, mereka dengan cepat mendorong penelitian mereka lebih jauh, menghubungkan modifikasi ini dengan diferensiasi sel hematopoietik (Science 2009) dan kemudian juga menemukan bahwa kelainan (mutasi Tet2, penghapusan) sangat terkait dengan tumorigenesis hematologi (Nature 2010). Seorang tokoh terkemuka dalam epigenetik, Yi Zhang, juga dengan cepat turun tangan pada saat ini dan menemukan bahwa modifikasi hidroksimetilkitosin yang diperantarai oleh Tet1 memainkan fungsi penting dalam mempertahankan fungsi pembaharuan diri (pembaruan) sel punca (Nature 2010). Pada tahun 2011, penelitian tentang modifikasi hidroksimetilasi DNA menjadi fitur reguler di Nature (Nature 18 Juli 2010; Nature 30 Maret 2011; Nature 03 April 2011; Nature, 13 April 2011, Cell 14 April 2011). Anjing Tua, Trik Baru Ini juga merupakan temuan khas yang digerakkan oleh hipotesis. Model teoretis mereka adalah bahwa urasil, yang dibentuk oleh deaminasi metilkitosin, hanya dapat terjadi pada RNA, dan jika terjadi pada DNA, baik karena sel mengira telah tercampur dengan bahan yang salah selama sintesis atau karena secara kimiawi dirusak oleh suatu basa, singkatnya, sel tersebut memicu perbaikan eksisi basa (perbaikan eksisi basa). (perbaikan eksisi dasar, BER), yang memiliki kemiripan dengan NER. Pada titik inilah sebuah molekul, AID (base cytosine deaminase), yang ditemukan pada awal tahun 1990-an memainkan peran penting dalam kemampuan sistem kekebalan tubuh untuk berkembang, masuk ke dalam benak mereka yang mengeksplorasi demetilasi DNA. AID pada awalnya dikloning di laboratorium ahli imunologi Jepang yang terkenal, Honjo T. Kloning dan penjelasan fungsional AID merupakan langkah besar dalam pengembangan sel B dan pembentukan keragaman antibodi. Sistem yang digunakan oleh M. Azim Surani dan Wolf Reik kali ini adalah sel germinal primer. Pada sel knockout AID, kedua laboratorium menemukan bahwa demetilasi sperma terpengaruh secara signifikan, tetapi masih terjadi secara parsial, yang menunjukkan adanya mekanisme lain. Pada akhirnya, mereka berdua mengkonfirmasi bahwa demetilasi yang terlibat dalam AID dilakukan dengan memulai perbaikan eksisi basa melalui deaminasi sitosin termetilasi. Ini seperti mencabut bagian tertentu dari seluruh bangunan dan menggantinya dengan yang baru. Ini tidak cukup ekonomis, tetapi memang terjadi, dan kita hanya bisa mempercayai fakta daripada pengalaman dan akal sehat. Model Penelitian 2: Penyaringan Sistematis Bagaimana jika tidak ada petunjuk, tidak ada petunjuk, tidak ada ide (hipotesis)? Tebar jaring dan tangkap mereka secara sistematis. Stephen J. Elledge membuat kekayaannya dengan membangun sistem penyaringan RNAi yang kuat, sebuah “jaring” berukuran super dan sangat kuat. Dia membangun sistem penangkapan ikan super ini seperti kapal penangkap ikan yang sangat besar, dilengkapi dengan jaring yang sangat besar (untuk menangkap semua gen), otomatis (sistem barcode + chip gen), dan menjadi raja laut dalam penelitian genomik fungsional. Pada tahun 2009, laboratorium Yi Zhang di North Carolina merancang sebuah eksperimen yang cerdik dengan menggunakan sel telur yang telah dibuahi dan berhasil membuka celah kecil. Pertama, mereka menemukan metode untuk mendeteksi status metilasi DNA genom dalam sel hidup. Ada kelas protein dalam sel yang secara khusus mengenali dan mengikat DNA yang dimetilasi (MBD), dan jika MBD dihubungkan (menyatu) ke protein fluoresen hijau, ini setara dengan menambahkan tag fluoresen ke MBD, sehingga lokasi MBD dapat secara langsung diamati dan dilacak di bawah mikroskop. Secara umum, MBD-GFP berikatan dengan DNA termetilasi pada genom dan muncul sebagai titik hijau (fokus) di bawah mikroskop fluoresensi; ketika metilasi genom dihilangkan, MBD-GFP tidak memiliki tempat lain untuk berikatan dan oleh karena itu tersebar di dalam nukleus, di mana di bawah mikroskop, bintik-bintik fluoresen hijau asli tersebut menghilang dan menjadi hijau menyebar. Dengan cara ini, perubahan dalam metilasi genom dapat ditentukan dengan mengamati perubahan dalam sinyal fluoresen. Dengan indikator penilaian ini, Anda dapat melakukan penyaringan. Gen yang dipilih “dihilangkan” satu per satu oleh gangguan RNA dan kemudian sinyal fluoresensi diamati. Jika sinyal seperti titik fluoresen dalam sel telur yang telah dibuahi tidak menghilang atau menghilang dengan sangat lambat setelah suatu gen diganggu, hal ini menunjukkan bahwa gen tersebut mungkin terlibat dalam proses demetilasi genom. Ini adalah layar yang sangat besar, dengan 4.000 gen yang disaring, dan mereka akhirnya menemukan kandidat positif, yang ternyata adalah faktor pemanjangan transkripsi, ELP3, yang mekanismenya masih belum jelas. Baru-baru ini, Song Hongjun, seorang ilmuwan Tiongkok di Fakultas Kedokteran Universitas Johns Hopkins, menerbitkan sebuah makalah penelitian dalam edisi terbaru Cell yang menyatukan reaksi hidroksimetilasi yang dikatalisis Tet1 dengan reaksi deaminasi yang dikatalisis AID. Lempeng demetilasi DNA yang dulunya tertutup rapat akhirnya terbongkar; tentu saja, ada banyak emas dan perak di sana, tidakkah Anda ingin masuk dan mengambilnya?