Sebagian besar kutil dapat didiagnosis dengan mata telanjang, tetapi beberapa tidak dapat didiagnosis secara klinis untuk sementara waktu dan bergantung pada laboratorium atau reagen lain untuk membuat diagnosis, seperti dengan kutil datar, yang memerlukan tes serologis sifilis. Berikut ini adalah beberapa tes yang umum digunakan.
Fakta sebenarnya adalah bahwa Anda akan bisa mendapatkan lebih dari sekadar beberapa yang paling populer dan paling populer.
Tujuan utama dari tes asam asetat adalah untuk mendeteksi infeksi HPV subklinis, terutama pada wanita dengan infeksi HPV subklinis serviks. Sangat cocok untuk studi klinis dan epidemiologi umum karena sensitivitas dan kesederhanaannya yang baik.
Telah didokumentasikan dengan baik bahwa infeksi HPV subklinis jauh lebih umum daripada lesi yang signifikan secara klinis dan hanya dapat dideteksi dengan metode tertentu. Infeksi HPV subklinis pada awalnya ditemukan di serviks dan kemudian di vulva wanita, penis pria, dan area perianal. Infeksi HPV subklinis dapat ditemukan sendiri atau dalam bentuk kutil yang terlihat dengan mata telanjang. Dalam beberapa tahun terakhir, sejumlah penelitian telah mengkonfirmasi hubungan antara infeksi HPV dan neoplasia, sehingga infeksi HPV subklinis semakin mendapat perhatian. Ada sejumlah metode laboratorium untuk mendeteksi infeksi HPV, termasuk metode imunologi, teknik hibridisasi molekuler asam deoksiribonukleat, dan reaksi berantai enzim polimorfik. Tes serologis belum tersedia dan HPV tidak dapat dikultur. Meskipun metode eksperimental di atas memiliki beberapa sensitivitas dan spesifisitas, namun metode ini sulit diterapkan dalam praktik klinis dan epidemiologi umum karena memerlukan peralatan dan teknik laboratorium yang lebih kompleks. Dalam beberapa tahun terakhir, beberapa ahli telah menyarankan untuk menggunakan kemampuan asam asetat untuk mengubah area yang terinfeksi HPV menjadi putih untuk mendeteksi infeksi HPV subklinis, menunjukkan bahwa metode ini, bila dikombinasikan dengan teknik amplifikasi, akan menjadi metode yang lebih sederhana, lebih aplikatif, dan lebih akurat. Sementara metode ini pertama kali digunakan untuk mengidentifikasi area yang mencurigakan dari infeksi HPV pada serviks wanita, baru-baru ini minat telah bergeser untuk mendeteksi kerusakan subklinis pada pasangan seksual pria dari wanita dengan kerusakan kutil kelamin atau pertumbuhan intraepitelial. Dalam penyelidikan baru-baru ini, 72% dari 51 pasangan seksual pria dari wanita dengan manifestasi histologis kondiloma akuminatum diidentifikasi oleh kolposkopi sebagai infeksi HPV tanpa gejala setelah aplikasi larutan asam asetat 5% ke kulit permukaan penis normal.
Metode dan alasan
Kapas yang dicelupkan ke dalam larutan asam asetat 3% hingga 5% dioleskan pada kulit yang diduga rusak dan pemutihan yang dihasilkan (juga dikenal sebagai asetat putih – asetonhite) umumnya dapat diamati setelah 1 menit. Namun, pada vulva wanita, pemutihan asam asetat hanya dapat diamati setelah 3 hingga 5 menit. Pada pria, ketika diperiksa, penis dan skrotum harus ditutupi dengan kasa yang direndam asam asetat 3% hingga 5% selama 3 hingga 5 menit, dan kemudian kulit luar harus diamati dengan pembesaran 10 hingga 16 kali untuk mencari kutil tersembunyi atau area pemutihan asam asetat. Jangka waktu yang lebih lama, biasanya 15 menit, mungkin diperlukan untuk memutihkan lesi perianal dengan percaya diri. Uji asetat putih telah ditingkatkan dengan penggunaan teknik pembesaran dan terutama penggunaan pengamatan kolposkopi secara simultan, yang membuat area asetat putih lebih terlihat dengan pembesaran kolposkopi, tetapi dalam banyak kasus penggunaan kaca pembesar sederhana sudah cukup.
Mekanisme kerja uji asetat putih, yang membuat kutil yang tidak mencolok terlihat dengan mata telanjang, belum diklarifikasi. Salah satu teori menunjukkan bahwa pemutihan adalah hasil dari koagulasi protein, dan bahwa protein ini mencerminkan sel-sel abnormal dan karakteristik kelebihan seluler dari epitel yang terinfeksi HPV. Teori lain mendalilkan bahwa epitel yang terinfeksi HPV memiliki keratin yang berbeda dari epitel normal yang tidak terinfeksi dan hanya epitel yang pertama yang dapat diputihkan oleh asam asetat.
Presentasi tentang kolposkopi
Setelah penggunaan asam asetat, fitur kolposkopi dari infeksi HPV subklinis pada serviks adalah lesi mengkilap, seputih salju dengan margin bergerigi, bersudut, atau berbulu yang tidak teratur. Terdapat lesi satelit yang menyebar di luar area metastasis, sementara gambaran kapiler dapat terlihat, biasanya terdiri dari pembuluh darah dengan kaliber yang sama dalam susunan yang longgar dan tidak teratur yang sering kali menyerupai saringan pada permukaan horizontal, dan kolateral kapiler yang melebar juga dapat meluas secara vertikal ke permukaan, menyebar ke seluruh lesi dengan diameter kanal yang sama. Jika gambar vaskular tidak cukup jelas akibat penyempitan pembuluh darah kecil yang disebabkan oleh asam asetat, filter hijau dapat ditambahkan ke kaca pembesar untuk membuat gambar lebih jelas.
Seperti halnya kolposkopi serviks, zona putih asam asetat dari infeksi HPV genital pria cerah, putih bersalju, dan berkilau pada kolposkopi. Perlu dicatat bahwa 22% infeksi HPV subklinis pada pria terjadi pada skrotum, yang mungkin merupakan tempat penularan HPV yang penting karena sedikit perhatian diberikan pada area anatomi ini sebagai tempat perlindungan yang mungkin untuk HPV. Wikstrom telah mengklasifikasikan presentasi asetat putih pada alat kelamin pria menjadi tiga jenis, tergantung pada pembesarannya.
1. tipikal: mudah dibedakan, kerusakan marginal yang sedikit meningkat terlihat serta kapiler pusat belang-belang yang terkait dengan atau tidak terkait dengan depresi epitel.
2. Kerusakan yang berbeda dan terlihat dengan margin yang mudah dibedakan, sedikit meninggi tetapi tidak memiliki kapiler belang-belang yang berbeda.
3. atipikal: kerusakan yang menunjukkan margin yang tinggi dan tidak rata serta tidak memiliki kapiler belang-belang.
Aplikasi klinis
Survei Wikstrom menunjukkan bahwa 62% infeksi HPV yang khas dan jelas pada uji asetat putih konsisten dengan temuan histopatologis. Sebaliknya, hanya 11% dari presentasi atipikal yang konsisten. Bila didasarkan pada temuan histopatologis, sensitivitas uji asetat putih adalah 85% dan spesifisitasnya 12%. Jika didasarkan pada teknik blotting asam nukleat dan hibridisasi in situ, sensitivitasnya 85% dan spesifisitasnya 11%. Karena sensitivitas uji asetat putih dan kesederhanaan metodenya, yang tidak memerlukan instrumentasi yang rumit, maka sangat cocok untuk studi klinis dan epidemiologi umum.
Tes asetat putih terutama digunakan dalam praktik klinis untuk mendeteksi infeksi HPV subklinis. Karena sebagian besar infeksi HPV serviks pada wanita bersifat subklinis, maka infeksi ini hanya terlihat dengan penggunaan asam asetat. Pada wanita, kondiloma vulva sering terjadi, tetapi sering dikombinasikan dengan infeksi subklinis, sehingga penggunaan tes asetat putih pada vulva untuk mendeteksi infeksi HPV subklinis dapat mengidentifikasi sumber kondiloma berulang. Kedua, adalah mungkin untuk mengenali infeksi HPV subklinis sebagai kemungkinan penyebab gatal-gatal vestibular yang sebelumnya tidak dapat dijelaskan, sensasi terbakar dan ketidaknyamanan selama hubungan seksual, yang bisa sangat menyusahkan bagi pasien. Kondisi yang terakhir ini biasanya berdurasi lama dan dapat salah didiagnosis sebagai infeksi Candida, yang hanya dapat diperburuk oleh pengobatan yang berkepanjangan dan tidak efektif.
Infeksi HPV subklinis pada alat kelamin pria dapat menyebabkan lesi kecil yang tidak dapat dipalpasi yang tidak mudah terlihat dengan mata telanjang, terutama papula dan lesi tambal sulam, yang sulit dideteksi bahkan pada pemeriksaan yang sangat rinci dan dapat muncul sebagai “area pemutih asam asetat” yang terdefinisi dengan baik dengan penggunaan asam asetat. Skrining infeksi HPV subklinis pada pria berisiko tinggi penting untuk pencegahan kanker serviks pada wanita. Telah disarankan bahwa pria dengan infeksi HPV yang secara klinis tidak signifikan dapat menjadi sumber HPV yang berpotensi menyebabkan kanker pada wanita. Dalam sebuah survei di London terhadap 75 pasangan seksual pria dari wanita dengan neoplasia intraepitel serviks yang didiagnosis secara histologis (CIN grade III), 49 (65%) ditemukan memiliki infeksi HPV penis yang dikonfirmasi secara histologis, 16% menunjukkan kerusakan yang terlihat secara klinis, dan 49% memiliki infeksi HPV subklinis yang dikonfirmasi oleh tes asetat putih dan kolposkopi.
Infeksi HPV subklinis sering terjadi dan beberapa kasus yang diidentifikasi dengan tes asetat putih pada prinsipnya harus diobati, tetapi dalam praktiknya hal ini sulit dilakukan. Saat ini sebagian besar dokter hanya mencoba untuk menghilangkan kutil yang terlihat dengan mata telanjang dan tidak berhati-hati untuk mengidentifikasi kerusakan subklinis. Pengujian asetat putih hanya dilakukan pada pasien dengan kekambuhan yang sering terjadi dan saat skrining untuk jenis kelamin pada pasien dengan penampilan klinis normal.
Yang pertama adalah penggunaan istilah “peroksidase”.
Tes ini biasanya dilakukan dengan metode antiperoksidase peroksidase (yaitu PAP), yang menunjukkan protein virus di dalam kutil untuk menunjukkan adanya antigen virus dalam kerusakan kutil.
Hal pertama yang perlu Anda lakukan adalah melihat situs webnya.
Sejumlah kecil jaringan diambil dan diwarnai dengan antibodi khusus untuk virus papiloma manusia. Jika antigen virus terdapat dalam lesi, kombinasi antigen-antibodi ada. Dalam metode peroksidase-anti-peroksidase (PAP), nukleus dapat diwarnai merah. Metode ini spesifik dan relatif cepat dan berguna untuk diagnosis.
IV. Pemeriksaan patologis
Ciri-ciri utamanya adalah keratinisasi yang tidak lengkap, hipertrofi yang tinggi pada lapisan spinous, hiperplasia papillomatous, penebalan dan perpanjangan tonjolan epidermis, yang mungkin menyerupai hiperplasia mirip pseudoepithelioma. Sel berduri dan sel basal memiliki pembelahan nuklir yang cukup banyak dan menyerupai karsinoma. Namun demikian, sel-selnya tersusun secara teratur dan batas antara epitel yang berproliferasi dan dermis terlihat jelas. Hal ini dicirikan oleh pembentukan vakuola yang khas pada lapisan granular dan di bagian atas lapisan berduri. Sel-sel vakuolasi ini lebih besar daripada normal, dengan sitoplasma berwarna terang dan inti pusat yang besar, bulat, dan sangat basofilik. Kondiloma raksasa Bushke-loewenstein, dengan pertumbuhan epidermis ke bawah yang ekstrem, menggantikan jaringan di bawahnya dan mudah dikacaukan dengan sel skuamosa, sehingga diperlukan beberapa biopsi. Jika ada kecenderungan untuk perkembangan yang lambat, ini adalah proses keganasan tingkat rendah yang dikenal sebagai karsinoma verrucous.
V. Diagnosis genetik
Sampai saat ini, HPV sulit dideteksi dengan menggunakan kultur virus tradisional dan teknik serologis, dan teknik diagnostik utamanya adalah hibridisasi asam nukleat. Metode PCR yang dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir memiliki keunggulan spesifisitas, sensitivitas, kesederhanaan dan kecepatan, membuka jalan baru untuk deteksi HPV.
(i) Pengumpulan dan pemrosesan spesimen
1. Pengumpulan spesimen dan pra-perawatan: Sekresi dan sel diambil dari vagina dan ektoserviks dengan pengikis atau kapas yang disusupi saline. Saat melakukan pemeriksaan sitologi, spesimen ditempatkan dalam 5 ml PBS yang mengandung 0,05% thimerosal, dicuci dua kali dengan PBS dengan sentrifugasi (3000 g, 10 menit), sel-sel yang disimpan diresuspensi dalam 1 ml PBS dan 0,5 ml suspensi sel diambil untuk ekstraksi DNA.
2. Ekstraksi asam nukleat dari spesimen: 1 volume suspensi sel ditambah 10 kali volume larutan lisis sel (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 10 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 0,4% SDS, 1,0 mg/ml proteinase K) diperlakukan semalaman pada suhu 37°C; dan volume yang sama dari fenol/kloroform (1:1), kloroform/iso (24:1) masing-masing dua kali; tambahkan 1/10 volume 3 mol/L NaAc (pH 5.2) dan 2.5 kali volume etanol anhidrat pada -20°C selama 2 jam atau semalam untuk mengendapkan DNA; cuci sekali dengan 1 volume etanol; lisis dengan 60 μl larutan TE (10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 1.0 mmol / L EDTA) dan inkubasi selama 30 menit pada 37 ° C.
(II) Amplifikasi PCR
1. Desain dan sintesis primer: Genom HPV dapat dibagi menjadi wilayah awal (E) dan wilayah akhir (L), masing-masing berisi serangkaian kerangka baca terbuka (ORF). Analisis sekuens menunjukkan bahwa ada sekuens yang dilestarikan di daerah non-coding dari setiap tipe HPV dan di daerah E1, E6, E7 dan L1. Manos et al. merancang primer sintetis MY11 dan MY09 dari sekuens yang dilestarikan di daerah L1 HPV seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, yang memiliki sekuens komplementer dengan HPV tipe 6, 11, 16, 18 dan 33 dan juga dapat memperkuat HPV tipe lain.
2. Reagen reaksi PCR: Taq DNA polymerase (2 U/ml), 10 mmol/L penampung dNTP (10 mmol/L masing-masing dATP, dCTP, dGTP dan dTTP), 10× buffer PCR (500 mmol KCl, 40 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.5), 100 μmol / L MY11 dan MY09 reservoir, dan air suling yang disiapkan dalam gelas steril.
3. Metode dan prosedur amplifikasi PCR: 100 μl larutan reaksi PCR dalam tabung sentrifus plastik steril 0,5 ml siliconized digunakan untuk reaksi amplifikasi.
(1) Reagen reaksi pra-campuran disiapkan dan dikeluarkan sebelum percobaan. Reagen pra-campuran mencakup semua jenis reagen PCR kecuali DNA spesimen.
(2) Tambahkan 10 μl spesimen dan 90 μl reagen premix ke setiap tabung secara bergantian.
(3) Tambahkan 80-100μl minyak parafin dan sentrifus dengan cepat selama beberapa detik pada centrifuge benchtop untuk memungkinkan setiap reagen reaksi terkumpul di bawah lapisan minyak. Reagen PCR sekarang tersedia secara komersial dalam volume 25 μl, dan hanya DNA spesimen yang ditambahkan.
(4) Tempatkan tabung reaksi pada instrumen amplifikasi PCR dengan parameter bersepeda 95 ° C selama 30 detik, 55 ° C selama 40 detik, 72 ° C selama 50 detik untuk 35 siklus, dan akhirnya 72 ° C untuk ekstensi 5 menit.
4. Kontrol positif dan negatif harus disiapkan untuk setiap tes. Plasmid rekombinan yang mengandung HPV (100pg per reaksi) atau cell line yang mengandung HPV (misalnya Caski, HeLa) DNA sebagai kontrol positif, dan DNA cell line manusia tanpa HPV sebagai kontrol negatif.
(iii) Deteksi dan analisis produk amplifikasi
1 . Elektroforesis gel: Setelah reaksi amplifikasi, keluarkan tabung reaksi, dinginkan ke suhu kamar, ambil 10μl produk amplifikasi dan elektroforesis dengan gel poliakrilamida 5% -7% atau agarosa 1,5%, noda dengan etidium bromida, analisis hasil di bawah penganalisis UV, pita DNA tampak jelas pada berat molekul sekitar 450bp.
2. Hibridisasi asam nukleat: Jika tidak ada DNA yang jelas dengan elektroforesis gel atau jika spesifisitas pita DNA perlu ditentukan, probe campuran umum berlabel dan / atau probe tipe-spesifik dapat digunakan untuk hibridisasi Southern blot dan verifikasi hibridisasi spekel.
Probe oligonukleotida berlabel ATP 32P harus dibuat menurut metode standar dan harus memiliki aktivitas spesifik sekitar 107 cpm/pmol. Larutan hibridisasi harus mengandung 2 x 106-5 x 106 cpm probe / ml. Hibridisasi dilakukan pada suhu 55 ° C selama 2-3 jam dengan pengocokan lambat, diikuti dengan pencucian cepat membran yang dihibridisasi dengan larutan pencuci (2 x SSC, 0,1% SDS) pada suhu 30-55 ° C untuk menghilangkan probe berlebih. Membran kemudian dicuci dalam kondisi yang berbeda tergantung pada probe yang digunakan: untuk probe hibrida umum, membran dicuci pada suhu 55 ° C selama 10 menit; untuk probe MY12, MY13 dan MY16, membran dicuci pada suhu 56-57 ° C selama 10 menit dan dicuci ulang sekali dengan perubahan larutan; untuk probe MY14 dan WD74, membran dicuci pada suhu 58-59 ° C selama 10 menit dan juga dicuci ulang sekali dengan perubahan larutan.
Deteksi HPV dengan PCR lebih unggul daripada metode hibridisasi asam nukleat. Metode GP-PCR dapat mendeteksi 200 salinan DNA HPV dalam spesimen dengan analisis langsung hasil dengan elektroforesis gel, sedangkan jika produk PCR dideteksi dengan hibridisasi asam nukleat, sensitivitasnya meningkat dan 10 salinan DNA HPV dapat dideteksi.
Mengingat sensitivitas teknik PCR yang tinggi, penggunaan sel yang terkelupas dari saluran genital cukup untuk memenuhi persyaratan tes, menghindari kebutuhan untuk melakukan biopsi bahan dan menggiling jaringan. Secara umum, produk amplifikasi PCR dikenakan elektroforesis gel dan DNA yang dihasilkan dapat diamati untuk membuat diagnosis langsung. Oleh karena itu, teknik PCR untuk deteksi HPV adalah singkat, sederhana dan cepat.