I. Metode ABC (metode SP, LSAB, SABC dengan langkah yang sama)
>2 . Blokir peroksidase endogen (198 ml metanol atau air + 2 ml 30% H2O2) di kamar
13, Cuci air.
14, pewarnaan cahaya Hematoxylin, kebiruan, dehidrasi, transparansi, penyegelan.
II. Metode PAP
Langkah-langkah.
1, Bagian dewaxing ke air
2, memblokir peroksidase endogen (198 ml metanol atau air + 2 ml 30% H2O2) di ruangan
13, pewarnaan cahaya Hematoxylin, kebiruan, dehidrasi, transparan, penyegelan.
III. Metode APAAP
APAAP: Ini termasuk metode antibodi non-label, melalui antibodi anti-alkali fosfatase dengan spesifisitas tinggi dan menambahkan sejumlah besar alkali fosfatase ke antibodi anti-enzim, sehingga alkali fosfatase sepenuhnya terikat pada antibodi anti-enzim untuk membentuk kompleks APAAP yang larut, pengembang warna yang umum digunakan adalah BCIP / NBT, merah solid atau biru solid. Fitur tidak akan bereaksi dengan peroksidase endogen, sehingga latar belakang lebih bersih, terutama cocok untuk jaringan dengan peroksidase yang lebih endogen, seperti hati dan ginjal.
Langkah-langkah.
1, bagian dewaxing ke air (bagian beku atau apusan sel yang direndam dalam PBS selama 3 menit, tidak ada perbaikan antigen)
2, memblokir peroksidase endogen (198 ml metanol atau air + 2 ml 30% H2O2) di ruangan
13.Pewarnaan ulang (merah padat nuklir atau hematoxylin atau metil hijau) selama 1-2 menit, setelah pembilasan biasa, gelatin gliserol menutup film.
IV. Metode LDP (polimer dekstran berlabel) (metode dua langkah Envision)
Metode polimer berlabel enzim, penerapan teknologi polimer berlabel enzim, seperti sistem deteksi EnVison, penggunaan peroksidase lobak atau alkali fosfatase berlabel pada polimer glukosa, dan kemudian diligasi dengan antibodi sekunder, membentuk antibodi sekunder EnVison; seperti sistem deteksi PowerVision, penggunaan peroksidase lobak atau alkali fosfatase yang dilabeli pada fragmen asam amino. Karena lebih dari 20 situs pada polimer dapat berikatan dengan antibodi primer dan jumlah enzim pada polimer lebih tinggi, maka lebih sensitif daripada metode seperti ABC dan LSAB. Yang paling penting, karena tidak ada biotin yang ada pada antibodi sekunder dari sistem LDP, tidak ada reaksi silang dengan pengikatan biotin endogen seperti yang terlihat pada ABC, S-P dan metode lainnya, mengurangi pewarnaan non-spesifik dan latar belakang yang lebih bersih.
Langkah-langkah.
1, bagian dewaxing ke air
2, larutan metanol H2O2 0,3%: memblokir peroksidase endogen (198 ml metanol atau air + 2 ml 30% H2O2) selama 20 menit pada suhu kamar. Cuci dengan air keran.
3. Perbaikan antigen: (1) pencucian buffer TBS pH 7,2 tiga kali, pencernaan tripsin 37 ℃, 30 menit. Atau (2) sesuai petunjuk: cuci air suling, masukkan ke dalam larutan perbaikan antigen (Ph6.0) dalam perbaikan gelombang mikro 20 menit, atau pemanas tungku listrik 30 menit, atau autoklaf dengan tutup keluar dari gas 3 menit, pendinginan cepat; atau (3) sesuai petunjuk: tidak ada perawatan)
4, pencucian buffer PBS pH 7,2 sebanyak tiga kali.
5, tambahkan serum normal setetes demi setetes 37 ℃, 20 menit.
6, kocok serum berlebih, tambahkan antibodi primer, 37 ℃, 30 menit.
7 . Cuci tiga kali dengan buffer TBS pH 7,2.
8 . Tambahkan antibodi sekunder Envision tetes demi tetes, 37 ℃, 30 menit.
9, buffer TBS pH 7.2 dicuci tiga kali.
10.Pengembangan warna DAB selama 3-10 menit.
11, Cuci air.
>12, pewarnaan cahaya Hematoxylin, kebiruan, dehidrasi, transparansi, penyegelan.
V. Metode pewarnaan ganda
1.Bagian dewaxing ke air
2, Blokir peroksidase endogen (198 ml metanol atau air + 2 ml 30% H2O2) pada suhu kamar
20 menit. Cuci dengan air.
3, Perbaikan antigen: (1) buffer TBS pH 7,2 dicuci tiga kali, pencernaan tripsin 37 ℃, 30 menit. Atau (2) sesuai petunjuk: cuci air suling, masukkan ke dalam larutan perbaikan antigen (Ph6.0) dalam perbaikan gelombang mikro 20 menit, atau pemanas tungku listrik 30 menit, atau autoklaf dengan tutup keluar dari gas 3 menit, pendinginan cepat; atau (3) sesuai petunjuk: tidak ada perawatan)
4, pencucian buffer TBS pH 7,2 sebanyak tiga kali.
5, tambahkan serum normal 37 ℃, 30 menit (dapat digunakan tanpa).
6, kocok serum berlebih, tambahkan antibodi primer 37 ℃, 30 menit.
7, buffer TBS pH 7.2 dicuci tiga kali.
8, Tambahkan antibodi sekunder biotinilasi tetes demi tetes, 37 ℃, 30 menit.
9. Cuci tiga kali dengan buffer TBS pH 7,2.
10. Tambahkan ABC atau kompleks S-P (horseradish peroxidase) tetes demi tetes, 37 ℃, 45 menit.
11. Cuci tiga kali dengan buffer TBS pH 7,2.
>12, pengembangan warna DAB (coklat) atau AEC (merah) selama 3 ~ 10 menit.
13, buffer TBS pH 7.2 dicuci tiga kali.
>14, Tambahkan serum normal tetes demi tetes pada suhu 37 ℃ selama 30 menit. (Dapat digunakan tanpa)
15, kocok serum berlebih, tambahkan antibodi primer kedua 37 ℃, 30 menit.
16, buffer TBS pH 7.2 dicuci tiga kali.
17, tambahkan antibodi sekunder biotinilasi tetes demi tetes, 37 ℃, 30 menit.
18. Cuci tiga kali dengan buffer TBS pH 7,2.
19, Tambahkan kompleks alkali fosfatase tetes demi tetes, 37 ℃, 30 menit.
20, Cuci tiga kali dengan buffer TBS pH 7.2.
21, pengembangan warna BCIP / NBT (biru)
>22, Cuci air
23, Pewarnaan ulang metil hijau, dehidrasi, transparan, dan disegel.
Jika memilih horseradish peroxidase dapat memilih pengembangan warna DAB (coklat), pada langkah 21 dengan kompleks horseradish peroxidase, langkah 23 dengan pengembangan warna AEC (merah), tetapi perlu dicatat bahwa AEC tidak dapat disimpan untuk waktu yang lama. Jika Anda memilih yang lain untuk alkaline phosphatase dapat digunakan BCI/NBT, AP-Red, AP-Orange, dengan pengembangan warna BCI/NBT adalah yang terbaik.
VI. Metode Immunogold (IGS)
(1) Bagian-bagian tersebut secara rutin di dewax ke dalam air.
(2) Cerna dengan larutan tripsin 0,1% pada suhu 37 ℃ selama 10-30 menit.
(3) Cuci dengan air suling ganda 2 kali.
(4) Cuci dengan 0,05 mol / L TBS PH7.4 selama 10 menit.
(5) Penutupan ovalbumin 1% selama 10 menit.
(6) Tambahkan antibodi primer spesifik tetes demi tetes selama 2 jam pada suhu kamar atau semalaman pada suhu 4 ° C.
(7) Cuci 3 kali dengan 0,5 mol / L TBS PH7.4.
(8) Penutupan ovalbumin 1% selama 10 menit.
(9) Encerkan antibodi standar emas selama 45 menit pada suhu 37 ° C.
(9) 0,05 mol / L TBS PH7.4 sebanyak 3 kali.
(10) Cuci air suling ganda 2 kali.
(11) 1% Haldol selama 10 menit.
(12) Pencucian air suling ganda sebanyak 3 kali.
(13) Pewarnaan ulang, penyegelan dan pengamatan gliserol.
Hasil: Situs pengikatan emas koloid berwarna merah.
VII. Metode imunogold dan perak (IGSS)
(1) Bagian-bagian tersebut secara rutin di dewax ke dalam air.
(2) Bagian jaringan yang difiksasi dengan fiksatif yang mengandung merkuri harus dihilangkan merkurinya dengan alkohol yodium 0,5%, kemudian dihilangkan yodiumnya dalam larutan berair tiosulfat 0,5%, dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan air suling ganda, dan dicuci dengan 0,05 mol / L larutan TBS PH7.4.
(3) Pencernaan dengan larutan tripsin 0,1%, 37 ℃ selama 10-30 menit.
(4) Cuci dengan 0,05 mol / L TBS PH7.4.
(5) Penutupan dengan 1% ovalbumin selama 10 menit.
(6) Titrasi dengan pengenceran antibodi spesifik yang sesuai selama 1-2 jam pada suhu 37 ° C atau semalam pada suhu 4 ° C.
(7) Cuci 3 kali dengan larutan 0,05 mol / L TBS PH7.4.
(8) Penutupan ovalbumin 1% selama 10 menit.
(9) Titrasi dengan pengenceran antibodi berlabel emas yang sesuai pada suhu kamar selama 45 menit pada 37 ° C.
(10) Cuci 3 kali dengan 0,05 mol / L TBS PH7.2.
(11) Cuci 2 kali dengan air suling dan 2 kali dengan air suling ganda.
(12) Masukkan ke dalam larutan pengembangan perak selama 3-5 menit, hindari cahaya selama reaksi.
(13) Cuci dengan air suling.
(14) Bilas air keran, pewarnaan ulang cahaya hematoxylin.
(15) Dehidrasi, transparansi, penyegelan dan pengamatan.
Hasil: Situs pengikatan antibodi spesifik adalah partikel abu-abu-hitam, latar belakang berwarna abu-abu jernih, nukleus berwarna biru muda.