1 Definisi
PCR adalah metode eksperimental biologi molekuler untuk sintesis enzimatik in vitro dari fragmen DNA spesifik, terutama terdiri dari siklus termal berulang dari tiga langkah: denaturasi suhu tinggi, annealing suhu rendah dan ekstensi suhu sedang: yaitu, DNA templat pertama-tama didenaturasi menjadi untai tunggal pada suhu tinggi, dua primer anneal ke urutan komplementer pada masing-masing dari dua untai DNA templat di bawah DNA polimerase dan suhu yang sesuai, diikuti oleh DNA polimerase Primer annealed kemudian diperpanjang dengan empat deoksinukleotida trifosfat (dNTPs) sebagai substrat yang dikatalisis oleh DNA polimerase. Hal ini diulangi sehingga fragmen DNA yang terletak di antara dua sekuens yang diketahui diamplifikasi secara geometris.
2 Tinjauan historis reaksi berantai polimerase
2.1 Konsepsi paling awal dari amplifikasi asam nukleat in vitro
Diusulkan oleh Khorana dan rekannya pada tahun 1971 bahwa “gen tRNA dapat dikloning dengan mendenaturasi DNA, menghibridisasikannya dengan primer yang sesuai, memperluas primer dengan DNA polimerase, dan memberikan perhatian terus-menerus pada proses tersebut”. Namun, ide awal Khorana dkk. dilupakan karena sulitnya mengurutkan dan mensintesis primer oligonukleotida pada waktu itu, dan penemuan endonuklease restriksi DNA oleh Smith dkk. pada waktu itu (1970), yang memungkinkan untuk mengkloning gen secara in vitro.
3.2 Penemuan reaksi berantai polimerase
Baru pada tahun 1985 Mullis dkk. menemukan terobosan Polymerase Chain Reaction (PCR) di Laboratorium Penelitian Genetika Manusia PE-Cetus, Inc. di Amerika Serikat, membuat amplifikasi fragmen asam nukleat tanpa batas yang didambakan secara in vitro menjadi kenyataan. Prinsipnya mirip dengan replikasi DNA in vivo, kecuali bahwa PCR menyediakan kondisi yang sesuai untuk sintesis DNA in vitro dalam tabung reaksi. Ini dimulai dengan penggunaan fragmen Klenow DNA polimerase E. coli untuk memperkuat fragmen spesifik dari genom manusia. Karena enzim ini tidak tahan panas, enzim Klenow harus diisi ulang setelah setiap pemanasan DNA yang terdenaturasi. Proses ini memakan waktu, melelahkan, dan rawan kesalahan saat bekerja dengan banyak spesimen. Penerapan DNA polimerase tahan panas memudahkan untuk mengotomatisasi reaksi reaksi berantai polimerase, dan PE-Cetus memperkenalkan sikler termal reaksi berantai polimerase pertama, membuat otomatisasi teknologi ini menjadi kenyataan.
3 Pengembangan Teknologi Terkait Reaksi Rantai Polimerase
Perkembangan reaksi berantai polimerase dan teknologi terkaitnya sangat fenomenal. Simposium internasional pertama dan kedua tentang teknologi reaksi berantai polimerase diadakan di Amerika Serikat dan Inggris masing-masing pada tahun 1988 dan 1990. Simposium pertama berfokus pada penerapan reaksi berantai polimerase dan optimalisasi teknologi itu sendiri; simposium kedua berfokus pada Proyek Genom Manusia dan kemajuan terbaru dalam reaksi berantai polimerase. Hal ini mencerminkan pentingnya para ahli biologi menempel pada reaksi berantai polimerase.
(Tabel) Teknologi terkait reaksi berantai polimerase
Nama Penggunaan utama metode amplifikasi primer simpleks
Amplifikasi fragmen gen yang tidak diketahui
Reaksi rantai polimerase bersarang
Meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas reaksi berantai polimerase dan menganalisis mutasi
Reaksi berantai polimerase kompleks
Deteksi simultan dari beberapa mutasi atau patogen
Membalikkan reaksi berantai polimerase
Menguatkan urutan yang tidak diketahui di kedua sisi urutan yang diketahui, menyebabkan mutasi pada produk
Reaksi rantai polimerase primer spesifik tunggal
Menguatkan DNA genom yang tidak diketahui
Reaksi rantai polimerase primer satu sisi
Amplifikasi cDNA yang tidak diketahui dengan urutan yang diketahui
Reaksi rantai polimerase berlabuh
Analisis urutan dengan ujung yang berbeda
Reaksi Rantai Polimerase yang Efisien
Mengurangi dimerisasi primer dan meningkatkan spesifisitas reaksi rantai polimerase
Menyembuhkan reaksi berantai polimerase
Memfasilitasi pemisahan produk
Reaksi rantai polimerase terikat membran
Penghapusan kotoran yang mencemari atau residu produk reaksi berantai polimerase
Reaksi rantai polimerase kaset ekspresi
Menghasilkan fragmen DNA untuk protein sintetis atau mutan
Reaksi rantai polimerase yang dimediasi ligasi
Analisis metilasi DNA, mutasi, kloning, dll.
Reaksi Rantai Polimerase RACE
Amplifikasi ujung cDNA
Reaksi rantai polimerase kuantitatif
Kuantifikasi mRNA atau gen kromosom
Reaksi rantai polimerase in situ
Studi tentang proporsi sel yang mengekspresikan gen, dll.
Reaksi rantai polimerase hipotetis
Identifikasi bakteri atau efek genetik
Reaksi rantai polimerase primer generik
Amplifikasi gen terkait atau deteksi patogen terkait
Amplifikasi messenger untuk pengetikan fenotipik (pemetaan)
Analisis mRNA secara simultan dari sejumlah kecil sel
4 Teknik amplifikasi lainnya
Sejalan dengan perkembangan reaksi berantai polimerase dan teknik terkaitnya, teknik amplifikasi baru telah diciptakan. Teknik-teknik ini, masing-masing dengan kelebihan dan kekurangannya sendiri, melengkapi reaksi berantai polimerase, dan beberapa dapat dikombinasikan untuk membentuk keluarga besar teknik amplifikasi asam nukleat in vitro. Kami percaya bahwa dengan perkembangan teknologi biologi molekuler, anggota baru dari keluarga ini akan muncul.
Teknik amplifikasi asam nukleat in vitro lainnya (Tabel) Aplikasi teknis Deteksi sistem amplifikasi yang bergantung pada transkripsi (TAS) Deteksi sistem deteksi reaksi berantai ligase HIV (LCR) mutasi titik mutasi sistem replikasi urutan otonom (3SR) untuk mempelajari RNA, aplikasi klinis, kedokteran forensik dan deteksi rantai substitusi rantai lainnya (SDA), identifikasi gen sistem replikasi Qβ untuk meningkatkan sensitivitas deteksi probe reaksi probe melingkar untuk meningkatkan sensitivitas deteksi probe.
4.1 Reaksi Rantai Ligase (A)
Ligase chain reaction (LCR), teknik baru untuk amplifikasi in vitro dan deteksi DNA, terutama digunakan untuk studi mutasi titik dan amplifikasi gen target. LCR ditemukan dan dipatenkan oleh Backman pada tahun 1997 untuk mendeteksi mutasi titik dalam urutan gen target.
Prinsip dasar LCR adalah menggunakan DNA ligase. LCR memperkuat sejumlah besar gen target dengan secara khusus meligasi fragmen DNA untai ganda dalam siklus tiga langkah denaturasi-annealing-joining.
Efisiensi amplifikasi LCR sebanding dengan reaksi berantai polimerase, dan hanya dua siklus suhu yang digunakan untuk LCR dengan ligase tahan panas: denaturasi pada 94 ° C menit dan denaturasi dan ligasi pada 65 ° C selama sekitar 30 siklus. Deteksi produknya juga lebih nyaman dan sensitif. Saat ini, metode ini terutama digunakan untuk studi dan deteksi mutasi titik, deteksi patogen mikroba dan mutagenesis yang ditargetkan, dll. Metode ini juga dapat digunakan untuk diagnosis polimorfisme penyakit genetik basa tunggal dan produk penyakit genetik basa tunggal, identifikasi jenis spesies mikroba, dan studi mutasi titik pada onkogen.
4.2 Amplifikasi yang bergantung pada urutan asam nukleat (A)
Amplifikasi berbasis urutan asam nukleat (NASBA), juga dikenal sebagai replikasi urutan mandiri (3SR) atau teknik replikasi urutan regeneratif, pertama kali dilaporkan oleh Guatelli et al. pada tahun 1990. NASBA terutama digunakan untuk amplifikasi RNA, deteksi dan pengurutan.
Metode dasarnya adalah: tambahkan primer dan spesimen ke dalam larutan reaksi amplifikasi, buka struktur sekunder molekul RNA pada suhu 65 ℃ selama 1 menit, kemudian dinginkan hingga 37 ℃ dan tambahkan transkriptase balik, T7RNA polimerase dan RNase H, dan bereaksi pada suhu 37 ℃ selama 1 ~ 1,5 jam. Produk dapat dilihat di bawah UV dengan elektroforesis agarosa dan pewarnaan bromoethidium.
NASBA ditandai dengan pengoperasian yang mudah, tidak ada peralatan khusus dan tidak ada siklus suhu. Seluruh proses reaksi dikendalikan oleh tiga enzim, dengan siklus yang lebih sedikit dan kesetiaan yang tinggi, dan efisiensi amplifikasinya lebih tinggi daripada reaksi berantai polimerase, dengan spesifisitas yang baik.
4.3 Sistem amplifikasi yang bergantung pada transkripsi (A)
Sistem amplifikasi berbasis transkrip (TAS), yang dilaporkan oleh Kwen et al. pada tahun 1989, terutama digunakan untuk memperkuat RNA.
Fitur utama TAS adalah efisiensi amplifikasi yang tinggi karena jumlah salinan RNA-nya meningkat secara eksponensial sebesar 10, mencapai 2 × 106 salinan urutan target hanya dalam 6 siklus. fitur lain adalah spesifisitasnya yang tinggi karena TAS hanya dapat melakukan 6 siklus suhu dengan tingkat pencampuran yang rendah, ditambah dengan hibridisasi dengan sandwich manik-manik dekstran.
Meskipun metode ini memiliki spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi, namun proses siklusnya rumit dan membutuhkan penambahan reverse transcriptase dan T7RNA polymutase secara berulang-ulang, yang perlu dikaji lebih lanjut.
4.4 Reaksi replikasi Qβ (A)
Kacian et al. pertama kali melaporkan pada tahun 1972 bahwa Qβ replicase (Q-beta replicase) mengkatalisis fungsi replikasi diri dari templat RNA, yang dapat memperkuat templat alaminya MDV-1 RNA menjadi 109 pada suhu kamar selama 30 menit. Pada tahun 1986, Chu dkk. melaporkan bahwa dengan probe spesifik urutan target biotagged yang dapat hibridisasi ke MDV-1 RNA yang terkait afinitas. Pada tahun 1986, Chu dkk. melaporkan bahwa probe spesifik urutan target biotagged dapat digunakan untuk hibridisasi ke MDV-1 RNA yang terkait afinitas, yang dielusi dari MDV-1 yang tidak terikat, diikuti dengan penambahan replicase Qβ untuk memperkuat replikasi salinan MDV-1, dan kemudian dideteksi dengan pewarnaan etidium bromida atau hibridisasi dengan probe kedua yang homolog.
Qβ replicase adalah RNA polimerase RNA yang diarahkan RNA dengan 3 fitur: (i) Dapat memulai sintesis RNA tanpa panduan primer oligonukleotida. (ii) Secara khusus dapat mengenali struktur lipatan RNA yang unik dalam gen RNA karena pasangan basa intramolekul. (iii) Penyisipan urutan asam nukleat pendek ke dalam wilayah struktural RNA MDV-1 yang tidak terlipat, templat alami replikasi Q β, tidak mempengaruhi replikasi enzim. Dengan demikian, jika probe asam nukleat dimasukkan di wilayah ini, urutannya dapat diamplifikasi oleh Q β replicase juga.
Pada tahun 1988, Lizardi et al. memasukkan urutan gen target ke dalam plasmid MDV-1 dan mentranskripsi probe RNA MDV-1 yang dikatalisis oleh T7 RNA polimerase, yang dapat berhibridisasi dengan urutan target, kemudian mencuci probe yang tidak terhibridisasi dan menambahkan replikasi Qβ untuk memperkuat probe, dan probe yang diperkuat dapat digunakan sebagai templat untuk memperkuat secara eksponensial. Produk dideteksi dengan dua metode yang dijelaskan di atas. Sekarang teknik ini telah mengembangkan hibridisasi sandwich, saklar molekuler, dan replikasi yang bergantung pada target.
5 Contoh aplikasi teknik reaksi berantai polimerase.
Penelitian: kloning gen; sekuensing DNA; analisis mutasi; rekombinasi dan fusi gen; identifikasi dan regulasi sekuen DNA konjugasi protein; pemetaan situs insersi transposon; deteksi modifikasi gen; konstruksi gen sintetis; konstruksi vektor kloning atau ekspresi; deteksi polimorfisme endonuklease suatu gen
Diagnosis: bakteri (spirochetes, mycoplasma, chlamydia, mycobacterium, rickettsia, difteri, Escherichia coli patogen, disentri, Aeromonas hydrophila dan Clostridium difficile, dll. ); virus (HTLV, HIV, HBV, HPVS, EV, CMV, EBV, HSV, virus campak, rotavirus, B19 mikrovirus); parasit (malaria, dll.); penyakit genetik manusia (sindrom Lesh-Nyhan, geodistrofi, hemofilia, BMD, DMD, cystic fibrosis, dll.)
Imunologi: pemisahan HLA; karakterisasi reseptor sel-T atau diversifikasi antibodi; pemetaan genetik penyakit autoimun; kuantifikasi limfokin
Rekayasa genom manusia: pembuatan tanda tangan DNA dengan sekuens repetitif yang tersebar; konstruksi peta genetik (deteksi DNA, polimorfisme atau pemetaan sperma); konstruksi peta fisik; sekuensing, pemetaan ekspresi
Forensik: analisis spesimen TKP; HLA-DQ
Onkologi: kanker pankreas, kanker usus besar, kanker paru-paru, kanker tiroid, melanoma, keganasan hematologi
Biologi jaringan dan populasi: studi pengelompokan genetik; studi konservasi hewan; ekologi; ilmu lingkungan; genetika eksperimental.
Paleontologi: analisis spesimen arkeologi dan museum
Zoologi: diagnosis penyakit zoonosis, dll.
Botani: deteksi patogen tanaman, dll.