1 Dasar-dasar dan konsep reaksi berantai polimerase
1.1 Prinsip-prinsip dasar
Replikasi DNA dalam sel merupakan proses yang kompleks. Faktor-faktor dasar yang terlibat dalam replikasi adalah: DNA polimerase, DNA ligase, DNA template, primer RNA yang disintesis oleh enzim inisiasi, bahan nukleotida, ion-ion anorganik, pH yang sesuai, dan beberapa enzim dan faktor protein yang melepas superhelix dan double helix DNA.
Reaksi berantai polimerase adalah reaksi replikasi DNA dalam tabung reaksi, prinsip dasarnya mirip dengan in vivo, perbedaannya adalah bahwa enzim Taq tahan panas bukan DNA polimerase, dengan primer DNA sintetis, bukan primer RNA, pemanasan (denaturasi), pendinginan (anil, isolasi (ekstensi) dan metode lain untuk mengubah suhu DNA dapat direplikasi, denaturasi berulang, anil, siklus ekstensi, Anda dapat membuat amplifikasi DNA tak terbatas. Proses spesifik dari reaksi berantai polimerase adalah sebagai berikut.
Sistem reaksi berantai polimerase dihangatkan hingga sekitar 95 ° C, dan templat DNA untai ganda terurai menjadi dua untai tunggal, suatu proses yang dikenal sebagai denaturasi. Suhu kemudian diturunkan di bawah nilai Km primer, dan ujung 3′ dan 5′ dari primer masing-masing mengikat ke daerah komplementer dari dua templat DNA untai tunggal, suatu proses yang dikenal sebagai annealing. Ketika suhu sistem reaksi dinaikkan menjadi sekitar 70 ° C, Taq DNA polimerase tahan panas mengkatalisis penambahan berurutan empat deoksiribonukleotida ke ujung 3 ‘primer dengan cara komplementer dengan urutan nukleotida dari DNA templat, membentuk untai DNA yang baru lahir. Setiap siklus kira-kira menggandakan jumlah molekul DNA dalam sistem reaksi. Secara teoritis, itu meningkat menjadi 2 ^ n kali dengan bersepeda beberapa kali. Ketika setelah 30 siklus, hasil DNA mencapai 2^30 salinan, yaitu sekitar 10^9 salinan. Proses amplifikasi reaksi berantai polimerase ditunjukkan pada Gambar 8-1. Karena dalam prakteknya efisiensi amplifikasi tidak mencapai 2 kali lipat, maka seharusnya (1+R)^n, dengan R adalah efisiensi amplifikasi.
1.2 Faktor-faktor yang terlibat dalam sistem reaksi reaksi berantai polimerase dan perannya
Faktor-faktor yang terlibat dalam reaksi reaksi berantai polimerase terutama mencakup asam nukleat templat, primer, TaqDNA polimerase, penyangga, Mg2 +, deoksinukleotida trifosfat (dNTP), suhu reaksi dan nomor siklus, dan instrumen reaksi berantai polimerase. Peranan mereka dijelaskan sebagai berikut.
(I) Asam nukleat cetakan
Asam nukleat templat yang digunakan untuk reaksi berantai polimerase bisa berupa DNA atau RNA. ketika RNA digunakan sebagai templat, transkripsi terbalik pertama kali dilakukan untuk menghasilkan cDNA, dan kemudian siklus reaksi berantai polimerase normal dilakukan. Templat asam nukleat berasal dari berbagai sumber dan dapat diekstraksi dari sel yang dibudidayakan, bakteri, virus, jaringan, spesimen patologis, spesimen arkeologi, dll.
Jumlah templat DNA yang ditambahkan ke reaksi reaksi berantai polimerase biasanya 100-100000 salinan, dan keadaan seni saat ini telah memungkinkan untuk menyiapkan perpustakaan cDNA yang sesuai dari satu sel. jumlah templat DNA yang tepat dapat mengurangi ketidakcocokan basa yang disebabkan oleh beberapa siklus reaksi berantai polimerase.
Biasanya molekul DNA linear digunakan untuk DNA template, dalam kasus plasmid siklik, lebih baik memotongnya menjadi molekul linear dengan enzim terlebih dahulu, karena DNA siklik terlalu cepat digabungkan.
(II) Primer
Primer menentukan spesifisitas dan panjang produk amplifikasi reaksi berantai polimerase. Oleh karena itu, desain primer menentukan berhasil atau tidaknya reaksi reaksi berantai polimerase.
Ada dua jenis primer dalam reaksi berantai polimerase, yaitu, primer ujung 5′, yang merupakan oligonukleotida dengan urutan yang sama dengan ujung 5′ dari templat, dan primer ujung 3′, yang merupakan oligonukleotida yang komplementer dengan ujung 3′ dari templat. Persyaratan dasar untuk primer adalah: Panjang pendek primer akan mempengaruhi spesifisitas reaksi berantai polimerase, membutuhkan 16-30bp, karena 4 ^ 16 = 4,29×10 ^ 9, yang sudah lebih besar dari 3×10 ^ 9bp dari genom mamalia untuk memastikan pengikatan spesifik; primer yang terlalu panjang membuat suhu ekstensi melebihi suhu optimal Taq DNA polimerase (74 derajat), yang juga akan mempengaruhi spesifisitas produk. Kekhususan produk juga akan terpengaruh. Kandungan G+C umumnya 40%-60%. ③ Keempat basa harus didistribusikan secara acak, dan tidak boleh ada lebih dari tiga purin atau pirimidin identik yang berurutan. Terutama pada ujung 3′ primer, tidak boleh ada 3 G atau c yang berurutan, jika tidak maka akan membuat primer salah melengkapi daerah asam nukleat yang diperkaya G atau c, dan mempengaruhi spesifisitas reaksi berantai polimerase. Primer itu sendiri tidak boleh memiliki urutan komplementer yang menyebabkan pelipatannya sendiri, setidaknya primer itu sendiri tidak boleh memiliki lebih dari 3bp basa komplementer berturut-turut. Kedua primer tidak boleh saling komplementer satu sama lain, terutama ujung 3’ mereka. Sepasang primer tidak boleh memiliki lebih dari empat basa berurutan yang saling melengkapi satu sama lain untuk menghindari terciptanya primer dimer. Homologi antara primer dan daerah target non-spesifik tidak boleh melebihi 70% atau memiliki 8 basa komplementer berturut-turut yang homolog, jika tidak maka akan mengarah pada amplifikasi non-spesifik. (1) Ujung 3 ‘primer adalah titik di mana ekstensi dipicu. Oleh karena itu tidak boleh tidak cocok. Karena ATCG menyebabkan ketidakcocokan dengan pola tertentu, A pada ujung 3′ primer memiliki dampak terbesar, oleh karena itu, cobalah untuk menghindari basa pertama pada ujung 3′ primer adalah A. Ujung 3′ primer juga tidak boleh menjadi basis ketiga dari kodon pengkodean, agar tidak mempengaruhi kekhususan amplifikasi karena kesederhanaan posisi kodon ke-3. Ujung 5′ primer dapat dimodifikasi, termasuk penambahan situs pembelahan enzim, pelabelan dengan biotin, zat fluoresen, digoxin, dll., Pengenalan situs mutasi, pengenalan urutan promotor, pengenalan urutan DNA pengikat protein, dll. Desain primer paling baik dipandu oleh perangkat lunak komputer.
Konsentrasi primer dalam sistem reaksi umumnya diperlukan antara O,1 dan 0,5 μmol. Konsentrasi yang terlalu tinggi cenderung menghasilkan primer dimer, atau produk non-spesifik.
Nilai Tm primer terkait dengan suhu annealing dan dihitung sebagai Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T). Nilai Tm primer lebih disukai dalam kisaran 55-80 ° C, dengan mendekati 72 ° C menjadi yang terbaik.
(C) Polimerase TaqDNA tahan panas
Chien mengisolasi polimerase tahan panas pada tahun 1976, dan Erlich mengisolasi dan memurnikan polimerase tahan panas Tq yang cocok untuk reaksi berantai polimerase pada tahun 1986, yang meletakkan dasar bagi reaksi berantai polimerase untuk menjadi teknologi praktis, dan sekarang diproduksi oleh gen rekombinan. Taq DNA polimerase memiliki berat molekul 94 kD, dan rasio enzim pada 75 ° C adalah 150 bs / molekul. Suhu reaksi terlalu tinggi atau terlalu rendah untuk mempengaruhi perpanjangannya, Taq lei memiliki stabilitas termal yang tinggi. Eksperimen menunjukkan bahwa waktu paruh masing-masing adalah 40 menit, 30 menit dan 5 menit pada 92,5 ° C, 95 ° C dan 97,5 ° C.
Taqase yang dimurnikan tidak memiliki aktivitas eksonuklease 3′-5′ secara in vitro, sehingga tidak ada fungsi pembacaan korektif, dan dapat menyebabkan ketidakcocokan selama amplifikasi. Jumlah basa yang tidak cocok dipengaruhi oleh suhu, konsentrasi Mg2 + dan jumlah siklus. Biasanya, tingkat ketidakcocokan dari 30 siklus Taqase adalah sekitar 0,25%, yang lebih tinggi dari tingkat ketidakcocokan enzim Klenow. taqase menghasilkan tingkat mutasi pergeseran 1/30.000 dan tingkat substitusi basa 1/8000 dalam setiap siklus. menerapkan konsentrasi dNTP yang rendah (masing-masing 20 μmol/L), konsentrasi Mg2+ 1,5 mmol/L, dan suhu yang lebih tinggi dari 55°C untuk replikasi dapat meningkatkan kesetiaan Taqase, ketika tingkat ketidakcocokan rata-rata hanya 5×10^-6 kali/(nukleotida* siklus).
Taqase memiliki aktivitas seperti TdT yang mirip dengan end-transferase dan dapat menambahkan – basa ke ujung 3′ dari produk untai ganda yang baru dihasilkan, terutama dATP yang paling mudah ditambahkan. Oleh karena itu, untuk mengkloning produk reaksi berantai polimerase ke dalam vektor, dua perlakuan dapat digunakan: satu untuk membangun vektor dT; yang lainnya adalah menggunakan enzim Klenow untuk menghilangkan A dari ujung 3’, yaitu, setelah reaksi reaksi berantai polimerase, pertama-tama menonaktifkan Taqase dengan memanaskan pada suhu 99 ℃ selama 10 menit, sesuaikan konsentrasi Mg2 + menjadi 5-10mmol / L, tambahkan 1-2U Klenow fragmen, dan bertindak selama 15-20 menit pada suhu kamar. Setelah 15-20 menit aksi, A pada ujung 3 ‘terputus dan Taqase juga memiliki aktivitas transkripsi terbalik. Taqase juga memiliki aktivitas transkripsi terbalik. Aktivitas serupa untuk membalikkan transkriptase terjadi pada 68 ° C pada konsentrasi 2-3 mmol / L Mg2 +. Aktivitas transkripsi balik lebih baik dengan adanya Mg2+, dan dengan menggunakan aktivitas ini, dapat langsung digunakan dalam reaksi berantai RNA-polimerase, terutama untuk amplifikasi fragmen pendek.
Di masa lalu, amplifikasi reaksi berantai polimerase dengan enzim Taq, umumnya hanya dapat mengamplifikasi fragmen DNA kurang dari 400bp, setelah modifikasi struktur dan fungsi enzim, serta perbaikan metodologi reaksi berantai polimerase, sekarang dapat mengamplifikasi DNA lebih dari 20kb.
Jumlah enzim Taq yang ditambahkan dalam reaksi berantai polimerase juga sangat penting, terlalu sedikit tentu saja tidak baik, terlalu banyak di satu sisi pemborosan, tetapi juga menyebabkan amplifikasi non-spesifik, biasanya 1-2,5U enzim Taq per lOOμl larutan reaksi baik. Yang terbaik adalah menentukan konsentrasi enzim optimal dalam kisaran 0,5-5U. Masalah lain adalah bahwa meskipun Taqase adalah enzim alat dengan stabilitas termal yang baik, harus berhati-hati untuk menyimpannya pada -20 ° C.
(iv) Penyangga
Buffer memberikan pH yang sesuai untuk reaksi reaksi berantai polimerase dengan ion tertentu, umumnya 10-50 mmol/L. Buffer Tris-HCI (pH 8,3-8,8). Buffer yang mengandung 50 mmol/L KCl memfasilitasi annealing primer. Beberapa orang dan menambahkan albumin serum anak sapi (100 μg / L) atau gelatin (0,0%) atau Twen20 (0,05% -0,1%) atau dithiothreitol (DDT, 5 mmol / L), dll., Yang dianggap melindungi enzim Taq.
(E) Mg2 + Aktivitas Taqase membutuhkan Mg2 +. konsentrasi Mg2 + yang terlalu rendah, aktivitas Taqase berkurang secara signifikan; konsentrasi Mg2 + terlalu tinggi, dan enzim mengkatalisis amplifikasi non-spesifik. konsentrasi Mg2 + juga mempengaruhi annealing primer, suhu pelepasan templat dan produk reaksi berantai polimerase, generasi dimer primer, dll. Aktivitas Taqase hanya terkait dengan konsentrasi Mg2+ bebas, sedangkan pada sistem reaksi berantai polimerase, semua gugus fosfat dalam dNTP, primer, templat DNA, dll. Dapat berikatan dengan Mg2+ dan mengurangi konsentrasi Mg2+ bebas. Oleh karena itu, jumlah total Mg2 + harus 0,2-0,25 mmol / L lebih tinggi dari konsentrasi dNTP. Jika sistem reaksi mengandung agen pengkelat seperti EDTA, sebagian Mg2 + juga dapat diikat.
Untuk mendapatkan konsentrasi Mg2+ yang optimal, metode optimasi berikut dapat digunakan. Pertama, tidak ada Mg2 + yang ditambahkan ke buffer reaksi berantai polimerase kecil, dan sejumlah tertentu dari larutan penyimpanan 10 mmol / L Mg2 + yang dikonfigurasi ditambahkan ke setiap tabung reaksi, dimulai dengan gradien konsentrasi 0,5 mmol / L (0,5,1,0,1,5,2,0,2,5,……5. 0 mmol/L), perkiraan kisaran konsentrasi Mg2+ dapat ditentukan dari hasil elektroforesis setelah reaksi reaksi berantai polimerase, dan kemudian konsentrasi optimum Mg2+ dapat ditentukan secara tepat dengan meningkatkan dan menurunkan beberapa konsentrasi di atas dan di bawah konsentrasi ini sebesar 0,2 mmol/L.
(vi) dNTP
dNTP adalah bahan baku untuk sintesis reaksi reaksi berantai polimerase. Konsentrasi setiap dNTP harus sama, dan kisaran konsentrasi yang biasa adalah 20-200gmol/L. Dalam kisaran ini, keseimbangan antara jumlah produk reaksi berantai polimerase, spesifisitas, dan kesetiaan reaksi adalah optimal. Misalnya, ketika setiap dNTP adalah 20μmol / L, 2,6μg DNA 400bp dapat diproduksi secara teoritis. menjaga konsentrasi keempat dNTP di atas nilai Km mereka (10-15μmol / L) mempertahankan kesetiaan penggabungan basa; jika konsentrasi dNTP lebih besar dari 50mmol / L, aktivitas Taqase dapat dihambat.
(VII) Suhu reaksi dan jumlah siklus
1. Suhu dan waktu denaturasi
Langkah denaturasi dalam reaksi berantai polimerase sangat penting. Jika DNA templat dan produk reaksi berantai polimerase tidak dapat didenaturasi sepenuhnya, reaksi berantai polimerase tidak dapat berhasil. Suhu denaturasi dan waktu yang terlalu tinggi akan mempengaruhi aktivitas Taqase, suhu dan waktu denaturasi yang biasa adalah 95 ℃, 30 detik, kadang-kadang dengan 97 ℃, 15 detik. Meskipun untai DNA dalam suhu denaturasi ketika dua untai dipisahkan hanya beberapa detik, tetapi tabung reaksi di dalam untuk mencapai suhu yang diperlukan masih membutuhkan waktu tertentu, kelompok untuk memperpanjang waktu dengan tepat. Untuk memastikan bahwa DNA templat dapat didenaturasi secara menyeluruh. Lebih disukai 7-10 menit, kemudian atur langkah denaturasi ke 95 ° C / menit dalam siklus berikutnya.
Ketika memperkuat fragmen pendek 100-300bp, juga disarankan untuk menggunakan metode reaksi berantai polimerase dua langkah yang cepat, yaitu denaturasi (94-97 ° C), annealing dan ekstensi (55-75 ° C).
Untuk mencegah penguapan larutan reaksi pada suhu denaturasi, 1-2 tetes parafin cair dapat ditambahkan dalam tabung reaksi.
2. Suhu dan waktu denaturasi
Suhu denaturasi menentukan spesifisitas reaksi berantai polimerase, dan suhu denaturasi yang sesuai harus 5 ° C di bawah nilai Tm primer. Suhu annealing terlalu rendah, menyebabkan amplifikasi non-spesifik; meningkatkan suhu annealing dapat meningkatkan spesifisitas amplifikasi, sehingga suhu annealing harus ditentukan secara ketat. Waktu reaksi anil umumnya 1 menit.
Pada awal siklus pertama reaksi berantai polimerase, reaksi dimulai pada suhu yang jauh lebih rendah dari nilai Tm, dan karena enzim Taq masih aktif pada suhu rendah, ada kemungkinan produk non-spesifik atau dimer primer dapat muncul karena pasangan ligan non-spesifik primer dan templat, dan kemudian produk non-spesifik diamplifikasi berulang kali sepanjang reaksi berantai polimerase di kemudian hari, membuat reaksi berantai polimerase mengalami kegagalan serius. Untuk mencoba menghilangkan amplifikasi non-spesifik ini, hot start dapat digunakan. Ada beberapa metode hot start: salah satu metodenya adalah dengan menambahkan antibodi anti-Taqase ke sistem reaksi berantai polimerase. Antibodi mengikat Taqase dan menyebabkan penghambatan aktivitas Taqase. Oleh karena itu, pada awalnya, meskipun suhunya rendah dan primer dapat tidak cocok dengan templat, itu tidak menyebabkan amplifikasi non-spesifik karena Taqase tidak aktif; ketika denaturasi termal dilakukan, antibodi dinonaktifkan pada suhu tinggi dan Taqase dilepaskan, dapat berfungsi untuk melakukan amplifikasi spesifik pada langkah ekstensi selanjutnya
reaksi polimerisasi DNA spesifik pada langkah ekstensi selanjutnya. Metode hot-start lainnya menggunakan parafin untuk memisahkan Taqase dari sistem reaksi berantai polimerase, sehingga tidak ada amplifikasi non-spesifik pada suhu kamar pada awalnya juga. Ketika dihangatkan ke suhu denaturasi termal, parafin meleleh dan Taqase dicampur dengan sistem reaksi berantai polimerase terbalik, sehingga berfungsi pada langkah selanjutnya. Penggunaan start panas meningkatkan spesifisitas amplifikasi reaksi berantai polimerase.
3. Suhu dan waktu ekstensi
Suhu ekstensi umumnya sekitar 72 ℃, pada saat ini aktivitas Taqase 35-100 nukleotida per detik doping, fragmen 2kb dengan waktu 1 menit sudah mencukupi, jika fragmen DNA panjang, waktu amplifikasi dapat diperpanjang dengan tepat. Waktu ekstensi yang terlalu lama dapat menyebabkan amplifikasi yang tidak spesifik.
4. Jumlah siklus
Jumlah siklus terutama tergantung pada konsentrasi molekul target awal, misalnya, dalam molekul target awal untuk 3×10 ^ 5, 1,5×10 ^ 4, 1×10 ^ 3 dan 50 nomor salinan, jumlah siklus dapat 25-30, 30-35, 35-40 dari 40-45 masing-masing. terlalu banyak siklus akan meningkatkan jumlah produk non-spesifik dan jumlah ketidakcocokan basa. Peningkatan produk amplifikasi tidak menjadi eksponensial secara eksponensial pada akhir reaksi rantai polimerase, yang disebut efek plateau. Efek plateau mungkin terkait dengan faktor-faktor berikut: konsentrasi dNTP dan primer yang lebih rendah, rasio enzim-ke-template yang relatif lebih rendah, aktivitas enzim yang lebih rendah setelah beberapa siklus, dan denaturasi yang tidak lengkap dengan konsentrasi produk yang lebih tinggi yang mempengaruhi ekstensi primer.
(H) Instrumen reaksi berantai polimerase
Ada berbagai instrumen reaksi berantai polimerase impor dan domestik. Naik turunnya suhu instrumen dapat berupa pemanas gas, pemanas air, dan pemanas blok pemanas listrik. Parameter suhu, jumlah siklus dan waktu sekarang sebagian besar dikendalikan oleh komputer. Instrumen dapat dipilih sesuai dengan kebutuhan.
Karena metode reaksi berantai polimerase sangat sensitif, sejumlah kecil molekul target dapat diperluas ke jumlah yang tak terbatas. Oleh karena itu, penting untuk mencegah produk amplifikasi reaksi berantai polimerase mencemari lingkungan dan menyebabkan positif palsu berikutnya dalam reaksi berantai polimerase. Untuk alasan ini, instrumen reaksi berantai polimerase dan proses deteksi produk reaksi berantai polimerase harus dipisahkan dari persiapan spesimen dan persiapan tabung reaksi berantai polimerase sebanyak mungkin di ruang angkasa, lebih disukai di ruang terpisah. Ruang eksperimental biasanya dapat dibagi menjadi area pemrosesan spesimen, persiapan campuran reaksi dan area amplifikasi reaksi berantai polimerase, area analisis produk, dll.
2 Pemeriksaan PCR
PCR adalah metode untuk amplifikasi cepat gen spesifik atau urutan DNA tertentu secara in vitro, sehingga juga dikenal sebagai amplifikasi gen in vitro. Teknik reaksi berantai polimerase mirip dengan proses replikasi alami DNA dan spesifisitasnya tergantung pada primer oligonukleotida yang komplementer dengan kedua ujung urutan target.
2.1 Nilai normal PCR
Tubuh memiliki variasi dan proporsi flora yang normal dan tubuh berada dalam kondisi kesehatan yang dinamis dan seimbang.
2.2 Signifikansi klinis PCR
Reaksi berantai polimerase dapat dengan cepat dan spesifik mengamplifikasi gen target atau fragmen DNA yang diketahui dan dapat dengan mudah memperkuat gen target dalam campuran DNA awal pada tingkat picogram (pg) ke fragmen DNA spesifik pada tingkat nanogram, mikrogram, dan miligram. Akibatnya, teknologi reaksi berantai polimerase telah dengan cepat dan banyak digunakan dalam berbagai bidang biologi molekuler sejak awal.
Hasil yang tidak normal: Kelainan akibat berbagai penyakit, seperti sifilis. (1) Sifilis stadium I. Masa inkubasi 2 sampai 4 minggu, dengan massa merah gelap yang keras dan ulkus dangkal di daerah genital luar, dengan kekerasan seperti tulang rawan dan pembesaran kelenjar getah bening di sekitarnya. (2) Sifilis stadium II. Pada tahap pertama sifilis 1 sampai 2 bulan kemudian, kulit dan selaput lendir tubuh terjadi ruam umum simetris, ruam, papula, pustula, dll.. Bintik-bintik mukosa dan kutil datar dapat terjadi pada selaput lendir, yang sangat menular. (3) Sifilis stadium III. Sifilis stadium III juga dapat menyerang tulang, sendi, jantung dan pembuluh darah, bermanifestasi sebagai aortitis, atresia katup aorta dan aneurisma aorta, dll. Ini menyerang saraf sebagai konsumsi tulang belakang dan kelumpuhan umum (demensia paralitik), dll.
Orang yang membutuhkan skrining: pasien yang dicurigai menderita penyakit tertentu untuk skrining spesifik molekuler.