Dua tes tambahan yang paling penting untuk membedakan nodul tiroid jinak dan ganas adalah ultrasonografi tiroid dan biopsi aspirasi jarum halus (FNA). Pada tahun 1982, sebuah penelitian di luar negeri menunjukkan bahwa hanya 14% nodul tiroid yang tidak didiagnosis secara pasti sebelum operasi dengan FNA didiagnosis sebagai tumor tiroid ganas setelah operasi, sementara sebuah penelitian pada tahun 2007 mengkonfirmasi diagnosis tumor tiroid ganas setelah operasi. Sebuah studi tahun 2007 mengkonfirmasi perlunya FNA pra-operasi pada nodul tiroid yang mencurigakan, dan pada tahun 2007, proporsi nodul tiroid dengan FNA pra-operasi telah melampaui 50% (dengan kemajuan teknologi ultrasound, akurasi diagnosis ultrasound saat ini telah meningkat secara signifikan sejak kedua studi tersebut). Dua jenis utama biopsi tiroid pra-operasi adalah aspirasi jarum halus (FNA) dan aspirasi jarum kasar (CNB). FNA banyak digunakan karena tidak memerlukan anestesi lokal, dapat ditoleransi dengan baik oleh pasien, relatif mudah dilakukan, tidak terlalu banyak membutuhkan nodul, dan lebih hemat biaya. Namun, meskipun FNA memiliki banyak keuntungan seperti yang disebutkan di atas, FNA tetap memiliki keterbatasan. Kekurangan yang paling signifikan adalah bahwa relatif mudah untuk sampai pada diagnosis yang tidak meyakinkan. Sesuai dengan namanya, aspirasi jarum halus memiliki jarum yang lebih tipis, yang tidak terlalu invasif dan tidak nyaman, dan lebih mudah ditoleransi oleh pasien, tetapi karena jarumnya lebih tipis, tidak ada massa jaringan yang dapat diperoleh, melainkan hanya sel, yang membatasi keandalan diagnosis FNA. Kegagalan diagnosis dapat disebabkan oleh jumlah sel yang tidak mencukupi dalam aspirasi tusukan, jumlah darah yang banyak, apusan yang kental, atau apusan yang terlalu cepat, dan hal ini dapat terjadi pada 2-20% kasus. Kondisi lain yang tidak dapat didiagnosis secara pasti adalah AUS, dengan angka kejadian 3-6%. Sebagai contoh, adenokarsinoma folikel tiroid memerlukan bukti yang jelas dari invasi vaskular atau peritoneum untuk mengkonfirmasi diagnosis, yang tidak dapat dilakukan dengan diagnosis sitologi, dan aspirasi CNB untuk mendapatkan massa jaringan dapat mengkompensasi hal ini. Pedoman ini merekomendasikan agar pasien dengan diagnosis nondiagnostik dan AUS ditindaklanjuti dengan ultrasonografi, FNA ulangan (rFNA) atau pembedahan, jika diperlukan. Penelitian yang lebih baru telah membandingkan sensitivitas dan akurasi FNA/rFNA dan CNB dalam diagnosis nodul tiroid, baik secara nasional maupun internasional, dan hampir semuanya memberikan hasil yang serupa: CNB lebih akurat daripada FNA/rFNA dan memiliki sensitivitas yang lebih tinggi untuk nodul ganas. Namun, penggunaan CNB secara signifikan dibatasi oleh kebutuhan akan anestesi lokal, tingkat trauma yang relatif tinggi, toleransi pasien yang lebih buruk, kompleksitas prosedur yang lebih besar, periode kultur yang lebih lama, dan persyaratan nodal yang lebih berat. Berdasarkan hasil ini, FNA masih merupakan metode biopsi lini pertama untuk diagnosis pra operasi nodul tiroid, dan CNB merupakan alat diagnostik yang lebih baik dibandingkan dengan rFNA untuk pasien yang belum didiagnosis secara pasti dengan FNA. Pasien sering bertanya di klinik rawat jalan dan di bangsal tentang komplikasi setelah operasi FNA dan CNB. Hanya ada laporan sesekali dalam literatur tentang kasus perdarahan intra-tiroid setelah FNA/CNB yang memerlukan pembedahan segera atau metastasis dari saluran pungsi, dan tidak ada laporan dalam literatur tentang metastasis dalam jumlah besar dari saluran pungsi setelah operasi yang ditemukan. Sebagian besar pasien tidak mengalami komplikasi apa pun setelah biopsi atau hanya mengalami pembentukan hematoma paracentesis yang dapat diterima, sehingga kedua biopsi di atas relatif aman dan dapat diandalkan.