Penyakit kardiovaskular (CVD), berdasarkan aterosklerosis dan mikroangiopati, adalah komplikasi utama diabetes dan merupakan penyebab utama kecacatan dan kematian pada diabetes. Kerusakan dan disfungsi sel endotel (ECs) adalah faktor pemrakarsa dalam perkembangan dan perkembangan komplikasi vaskular diabetes. Oleh karena itu, telah menjadi topik hangat penelitian untuk menyelidiki mekanisme kerusakan endotel dan untuk menemukan cara yang efektif untuk memperbaiki struktur dan fungsi endotelium yang rusak.
Sel progenitor endotel (EPC) adalah sel yang berasal dari sumsum tulang yang dapat berkembang dan berdiferensiasi lebih lanjut ke dalam ECs secara in vitro dan berpartisipasi dalam perbaikan dan revaskularisasi endotelium yang rusak. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) sangat penting untuk kapasitas migrasi EPC.
Stres oksidatif dapat dipicu oleh kadar glukosa yang tinggi dalam tubuh, yang pada gilirannya dapat menyebabkan gangguan fungsi EPC dan mengurangi produksi oksida nitrat (NO), sementara intervensi dengan superoksida dismutase (SOD) dapat menyebabkan peningkatan sekresi NO dan pemulihan fungsi. Enzim antioksidan termasuk superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT) dan glutation peroksidase (GSH-Px), sementara sistem antioksidan non-enzimatik termasuk vitamin C, vitamin E, glutation, melatonin, asam alfa-lipoat (ALA), karotenoid, dan elemen jejak seperti tembaga, seng dan selenium (Se).
Dalam penelitian ini, EPC diinkubasi dengan konsentrasi glukosa yang tinggi untuk menginduksi stres oksidatif, dan tingkat malondialdehyde (MDA) dan nitric oxide (NO) dalam supernatan kultur diukur. Ekspresi mRNA GPx-1 dan eNOS diamati dengan RTPCR kuantitatif fluoresensi waktu nyata, dan ekspresi protein GPx-1 dan eNOS ditentukan oleh western blot, diikuti dengan aplikasi antioksidan ALA Kemudian, antioksidan ALA digunakan untuk mengintervensi untuk menyelidiki mekanisme kerusakan yang diinduksi glukosa pada EPC dan tindakan terapeutik untuk memberikan dasar pencegahan dan pengobatan komplikasi vaskular diabetes.
1. Bahan dan metode
1.1 Bahan
1.1.1 Hewan percobaan: 15 tikus Wistar jantan sehat kelas bersih (berat 180-200 g), disediakan oleh Pusat Hewan Percobaan Universitas Kedokteran Hebei, Sertifikat Hewan No. 902035.
1.1.2 Reagen Kit uji MDA dan NO (Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering), injeksi glukosa 50% (Huarui Pharmaceutical Co., Ltd.), media EGM-2MV (LONZA, USA), isolat limfosit tikus (Tianjin Hao Yang Co., Ltd.);
Fibronektin manusia (Solabank Technology Co., Ltd.), tripsin (sigma, USA), reagen ekstraksi RNA Trizol Reagent (Invitrogen, USA), reverse transcriptase (M-MLV), primer acak yang semuanya diproduksi oleh Promega, kelinci antibodi GPx-1 poliklonal anti-manusia (ABCAM, UK), kelinci anti-human polyclonal antibodi eNOS (Santa, USA), ALA (Eisai Pharmaceutical Co., Ltd., Jepang).
1.1.3 Instrumen eksperimen Spektrofotometer UV (756MC) (Shanghai Precision Instrument Science Co.
), ABI 7300 sistem PCR kuantitatif fluoresensi waktu nyata ABI 7300 (PE, USA), sistem pemindaian gel UVP (UVP, USA), instrumen elektroforesis waktu konstan ganda DYZ22A dan instrumen elektroforesis jembatan DYY-III (Beijing Liuyi Instrument Factory), mikroskop terbalik (Olympus, Jepang), meja ultra-bersih (HFsafe1200) (Likang Development Co., Ltd.), karbon dioksida inkubator (MCO-15AC) (Heraeus, Jerman), pelat kultur sel dan botol kultur (Corning, AS)
1.2 Metode Eksperimental
1.2.1 Kultur EPC sumsum tulang tikus
Tungkai bawah tikus dihilangkan dengan gunting bedah, kulit tungkai bawah dipotong, tungkai bawah direndam dalam alkohol 75% selama 30 menit, tulang paha dipisahkan dari tibia di sepanjang sendi lutut di meja ultra-bersih, otot tungkai bawah dihilangkan, tulang tungkai bawah terpapar dalam kondisi aseptik, direndam dalam cawan kultur yang mengandung PBS, tulang tungkai bawah dipotong dari kedua ujungnya, dan rongga sumsum tulang berulang kali dibilas dengan PBS di meja ultra-bersih;
Larutan pembilas kemudian secara perlahan ditumpangkan pada isolat limfosit tikus dan disentrifugasi pada 2000 rpm selama 20 menit. Setelah sentrifugasi, cairan dalam tabung dibagi menjadi tiga lapisan, lapisan keruh putih tengah disedot keluar, 4 kali volume PBS ditambahkan dan dicampur, dan supernatan dibuang dan disentrifugasi selama 10 menit, kemudian pencucian diulang sekali. Setelah sentrifugasi akhir, buang supernatan dan tambahkan EGM-2MV untuk meresuspensi sel.
Fn disebarkan ke dalam pelat sumur pada 5ug/cm2 dan suspensi sel diinokulasikan ke dalam pelat enam sumur dan pelat 24 sumur dengan kepadatan 2×106 sel/mL. Volume penuh cairan pertama diganti setelah 48 jam, kemudian setiap hari dan setiap hari setelah 7 hari. Pertumbuhan sel diamati setiap hari di bawah mikroskop terbalik.
1.2.2 Identifikasi 2EPC
Identifikasi morfologi: Amati morfologi dan pertumbuhan sel di bawah mikroskop terbalik setiap hari.
Pengambilan EPC dari DIL-Ac-LDL dalam kombinasi dengan FITC-Lectin-UEA-1: Sel pada hari ke-10 kultur ditambahkan ke medium yang mengandung DIL-Ac-LDL (2,5ug/mL), diinkubasi selama 4 jam, dicuci 3 kali dengan PBS, difiksasi dalam 2% paraformaldehyde selama 20 menit, kemudian FITC-Lectin-UEA-1 ditambahkan ( 10ug / mL), diinkubasi selama 1 jam, diamati di bawah mikroskop laser confocal, sel-sel yang diwarnai ganda sebagai oranye-kuning adalah EPC, dan sel-sel bernoda ganda dihitung.
1.2.3 Pengelompokan eksperimen
EPC dicerna dengan 0,25% tripsin/0,02% EDTA selama 4 hari dan dikelompokkan selama 24 jam.
EPC diinkubasi selama 48 jam dengan glukosa 5 mmol / L sebagai kontrol normal (NC), 30 mmol / l glukosa sebagai glukosa tinggi (HS) dan glukosa (30 mmol / l) + asam α lipoat (40µg / l) sebagai kelompok ALA.
1.2.4 NO dan MDA diukur dengan metode kolorimetrik kimia, metode Western blot untuk menentukan ekspresi GPx-1 dan eNOS di EPC, dan metode RT-PCR kuantitatif fluoresensi real-time untuk mengukur ekspresi GPx-1 mRNA di EPC.
1.3 Metode statistik
Semua data dianalisis dengan menggunakan paket analisis statistik SPSS 13.0. Semua data pengukuran dinyatakan sebagai rata-rata ± standar deviasi (±s). Beberapa cara sampel dibandingkan dengan menggunakan ANOVA satu arah dengan desain acak lengkap, dan perbedaan yang signifikan dianggap pada P<0,05. 2. Hasil 2.1 Pengaruh intervensi yang berbeda pada sekresi MDA oleh EPC (Tabel 3) Tingkat MDA supernatan kultur lebih tinggi daripada kelompok kontrol normal setelah 48 jam intervensi glukosa tinggi (P<0,05); tingkat MDA menurun setelah penerapan intervensi ALA dibandingkan dengan kelompok glukosa tinggi (P<0,05). 2.2 Pengaruh intervensi yang berbeda pada ekspresi GPx-1 dan eNOS pada EPC (Gbr1-4, Tabel 1) Ekspresi GPx-1 dan eNOS pada EPC secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol 48 jam setelah intervensi glukosa tinggi, sedangkan ekspresi GPx-1 dan eNOS pada EPC meningkat secara signifikan setelah intervensi ALA dibandingkan dengan kelompok glukosa tinggi (keduanya P<0,05). 2.3 Pengaruh intervensi yang berbeda pada ekspresi GPx-1 dan eNOS mRNA pada EPC (Gbr5-8, Tabel 2) Tingkat ekspresi GPx-1 dan eNOS mRNA pada EPC secara signifikan lebih rendah daripada kelompok kontrol setelah 48 jam intervensi glukosa tinggi, sedangkan ekspresi GPx-1 dan eNOS mRNA pada EPC meningkat secara signifikan setelah intervensi ALA dibandingkan dengan kelompok glukosa tinggi (keduanya P<0,05). 2.4 Pengaruh intervensi yang berbeda pada tingkat NO yang disekresikan dalam EPC (Gbr9, Tabel 3) Setelah 48 jam intervensi gula tinggi EPCs mengeluarkan tingkat NO yang lebih rendah daripada kelompok kontrol normal (P <0,05), sementara setelah intervensi ALA ekspresi eNOS EPCs meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok gula tinggi (P <0,05), dan kultur supernatan NO tingkat meningkat. 3. Diskusi Pada tahun 2004, pada pertemuan tahunan American Diabetes Association (ADA), Brownlee, pemenang Banting Award, memberikan ceramah: komplikasi makrovaskular dan mikrovaskular disebabkan oleh patogenesis yang sama, yaitu stres oksidatif, yang merupakan dasar umum dari kerusakan glukosa yang tinggi; pada tahun yang sama, Asosiasi Eropa untuk Studi Diabetes (EADS) memberikan ceramah tentang pentingnya patogenesis yang sama, yaitu stres oksidatif. Pada tahun yang sama, Ceriello, pemenang hadiah utama pada pertemuan tahunan European Association for the Study of Diabetes (EASD), memberikan ceramah tentang stres oksidatif sebagai mekanisme umum resistensi insulin, diabetes, dan penyakit kardiovaskular - teori common soil. EPC adalah sel prekursor yang terdapat dalam sirkulasi darah perifer yang dapat berdiferensiasi menjadi sel endotel vaskular (ECs), yang berasal dari sumsum tulang, darah tali pusat atau hati janin. Dalam kasus cedera vaskular atau iskemia jaringan, EPC yang ada di sumsum tulang dapat berproliferasi sebagai respons terhadap faktor pertumbuhan dan sitokin yang dilepaskan secara lokal, berdiferensiasi menjadi sel endotel yang matang dan memobilisasi ke sirkulasi perifer, di mana mereka secara khusus bersarang di lokasi cedera atau iskemia dan selanjutnya berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi sel endotel yang matang, berpartisipasi dalam neovaskularisasi vaskular dan endotelisasi ulang. Setelah jumlah dan fungsi EPCs terganggu, keseimbangan antara kerusakan dan perbaikan endotel terganggu dan integritas endotelium terganggu, yang mengakibatkan lesi ateromatosa. Oleh karena itu, sel progenitor endotel memainkan peran penting dalam mengatur keseimbangan apoptosis/regenerasi dan mempertahankan integritas lapisan endotel. Oleh karena itu, fungsi EPCs sangat erat kaitannya dengan perkembangan dan progresivitas komplikasi vaskular diabetes dan merupakan prediktor penyakit kardiovaskular. Dernbach et al [6] meneliti sensitivitas oksidatif EPC dewasa yang sehat dan menemukan bahwa EPC dewasa yang sehat memiliki tingkat ROS intraseluler yang lebih rendah dan apoptosis yang dimediasi oksidan yang lebih rendah daripada sel endotel vena umbilikalis, dan bahwa ekspresi antioksidan seperti mangan superoksida dismutase (MnSOD), GSH-Px dan CAT meningkat pada permukaan EPC dibandingkan dengan sel endotel vena umbilikalis, menunjukkan bahwa EPC yang sehat memiliki tingkat ROS intraseluler yang lebih rendah dan apoptosis yang dimediasi oksidan lebih rendah daripada sel endotel vena umbilikalis. EPC memiliki kapasitas antioksidan yang lebih kuat daripada sel endotel; Hal ini meningkatkan kelangsungan hidup mereka, tetapi tidak cukup untuk menangkal efek faktor risiko pada sistem antioksidan endogen EPC, yang tidak seimbang dalam keadaan redoks dalam EPC di bawah tingkat stres oksidatif yang tinggi, yang menyebabkan apoptosis dan penuaan, yang merusak fungsi mereka. Glukosa darah yang meningkat dapat mengaktifkan NADPH intraseluler melalui jalur PKC, menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS) dalam jumlah besar dan merusak sel, menyebabkan penurunan bioaktivitas seluler normal, gangguan metabolisme energi, pensinyalan sel dan fungsi lainnya, yang berarti bahwa stres oksidatif dapat diinduksi oleh kadar glukosa yang tinggi. Juga telah ditunjukkan bahwa glukosa tinggi dapat mempengaruhi mobilisasi sumsum tulang dan kelangsungan hidup EPC melalui stres oksidatif dan jalur P38MAPK. Pasien diabetes dan EPCs yang diobati dengan glukosa menyebabkan berkurangnya bioavailabilitas NO atau penurunan tetrahydrobiopterin (BH4), kofaktor eNOS, yang mengakibatkan tidak terkoordinasinya eNOS, menghasilkan ion negatif superoksida (O-) dan mengarah pada akumulasi spesies oksigen reaktif (ROS) cluster, yang selanjutnya mengurangi jumlah dan kapasitas migrasi EPCs. Stres oksidatif dalam sel yang dimediasi oleh oxLDL memainkan peran kunci dalam patogenesis aterosklerosis. OxLDL mempengaruhi fungsi EPC dengan mempromosikan penuaan mereka melalui efek penghambatannya pada EPC eNOS. Studi terbaru menunjukkan bahwa ox-LDL pada pasien diabetes menyebabkan disfungsi EPC melalui jalur pensinyalan yang dimediasi P53, berbeda dengan HDL yang dianggap sebagai faktor pelindung fungsi vaskular karena sifat antioksidan dan anti-inflamasi. Dalam penelitian ini, kami menginkubasi EPC yang berasal dari sumsum tulang tikus dengan glukosa tinggi selama 48 jam dan menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam kadar MDA dalam supernatan kultur, menunjukkan bahwa glukosa tinggi dapat menyebabkan stres oksidatif pada EPC. Hal ini dapat menyebabkan apoptosis dan kerusakan DNA oksidatif. GPx-1 adalah protein redoks utama yang berperan penting dalam melindungi endotelium dari stres oksidatif dan dengan demikian mempertahankan lingkungan vaskular yang stabil. Penelitian telah menunjukkan bahwa aktivitas GPx-1 menurun pada plak arteri karotis terisolasi. Juga telah ditunjukkan bahwa GPx-1 overekspresi mempertahankan fungsi endotel vaskular normal dalam sel endotel yang dikultur dengan konsentrasi sistein yang tinggi. Lebih jauh lagi, juga telah ditunjukkan bahwa kekurangan GPx-1 tidak hanya mengakibatkan disfungsi endotel vaskular, tetapi juga adanya kelainan struktur jantung dan pembuluh darah. Selain itu, sel Ac-LDL + Lectin + VEGFR-2 + eNOS + yang diisolasi dari tikus knockout GPx-1 secara fungsional cacat dalam mempromosikan angiogenesis dan telah meningkatkan sensitivitas terhadap stres oksidatif, baik in vivo maupun in vitro [21]. enzim antioksidan, sementara mengarah ke penuaan dan disfungsi EPCs in vivo, yang selanjutnya mengarah pada peningkatan apoptosis. eNOS adalah enzim mirip reduktase sitokrom P450 yang mengkatalisis transfer elektron yang dimediasi flavin dari donor elektron NADPH ke kofaktor subtilisin. kofaktor eNOS BH4 terletak dekat dengan gugus subtilisin dan dapat mentransfer elektron ke nitrogen guanidinium dari arginin L untuk menghasilkan NO. Dengan tidak adanya arginin L atau BH4, eNOS menghasilkan O2- dan H2O2, sebuah fenomena yang dikenal sebagai Fenomena ini dikenal sebagai eNOS uncoupling. Fenomena ini dikenal sebagai eNOS uncoupling. eNOS memainkan peran penting dalam mobilisasi dan regulasi fungsional EPCs. eNOS uncoupling menyebabkan peningkatan tingkat ROS, yang mengakibatkan gangguan fungsi EPCs. Pada pasien diabetes, eNOS uncoupling mengurangi jumlah EPC pada pasien diabetes, menurunkan fungsi mereka dan akhirnya mengarah pada perkembangan penyakit vaskular. Tikus knockout eNOS dapat menyebabkan penurunan kapasitas migrasi EPC [25], dan memastikan ekspresi eNOS yang memadai, sekresi NO yang normal dan aktivitas biologis yang normal merupakan faktor penting untuk mempertahankan fungsi biologis normal EPC. Dalam penelitian ini, kami menerapkan glukosa konsentrasi tinggi untuk mengintervensi EPC selama 48 jam dan menemukan bahwa Ekspresi protein GPx-1 dan tingkat ekspresi mRNA EPCs menurun, sementara terjadi penurunan ekspresi protein eNOS dan ekspresi mRNA serta down-regulation dan sekresi NO; Oleh karena itu, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa glukosa yang tinggi dapat menyebabkan stres oksidatif pada EPC selain menurunkan ekspresi enzim antioksidan, sehingga merusak kapasitas antioksidan mereka dan mempengaruhi fungsi mereka. ALA adalah antioksidan alami yang dapat mengais berbagai radikal bebas yang dihasilkan selama proses fisiologis dan patologis dan mengurangi stres oksidatif dalam tubuh. Penelitian telah menunjukkan bahwa ALA dapat meningkatkan fungsi endotel vaskular pada tikus dengan meningkatkan aktivitas NO, mengurangi produksi ROS [26] dan menghambat ekspresi NF-κB, dan juga dapat mengurangi tingkat stres oksidatif secara in vivo dengan mengaktifkan jalur AMPK dalam sel endotel dan membalikkan hiperpolarisasi membran mitokondria yang diinduksi glukosa tinggi. Dalam penelitian ini, dengan menerapkan intervensi ALA pada EPC yang diinkubasi dengan glukosa tinggi, ditemukan bahwa ekspresi GPx-1 dan eNOS diregulasi dalam EPC, sekresi NO meningkat dan sekresi MDA menurun pada EPC, yang menunjukkan bahwa pengobatan ALA dapat mengurangi stres oksidatif yang dihasilkan oleh EPC yang diinduksi oleh glukosa tinggi dan mengembalikan kapasitas antioksidannya, sehingga melindungi fungsi mereka. Kesimpulannya, konsentrasi glukosa yang tinggi dapat menginduksi stres oksidatif pada EPC di satu sisi, dan mengurangi produksi dan ekspresi enzim antioksidan mereka dan merusak kapasitas antioksidannya di sisi lain, sementara pengobatan stres anti-oksidatif dapat meningkatkan kapasitas antioksidan dan kapasitas sekresi NO dari EPC. Hal ini menunjukkan bahwa pengobatan stres anti-oksidatif memiliki implikasi untuk pencegahan dan pengobatan terjadinya dan perkembangan komplikasi vaskular diabetes.