Nodul tiroid adalah salah satu gangguan endokrin yang paling umum, yang hanya 5-15% berubah menjadi kanker tiroid. Kanker tiroid (TC) adalah keganasan endokrin yang paling umum, terhitung 1% dari semua keganasan dalam tubuh dan 91,5% keganasan pada kepala dan leher [1]. Karsinoma tiroid terdiferensiasi (DTC) menyumbang lebih dari 90% dari semua kanker tiroid, termasuk karsinoma tiroid papiler (PTC) dan karsinoma tiroid folikuler (FTC). Survei telah menunjukkan bahwa ada sekitar 122.800 kasus baru kanker tiroid di seluruh dunia setiap tahun, dengan kejadian PTC meningkat secara signifikan [2]. Prognosis karsinoma tiroid terdiferensiasi terkait erat dengan stadium dan oleh karena itu diagnosis dini sangat penting.
Banyak teknik diagnostik yang saat ini digunakan untuk diagnosis dini kanker tiroid: ultrasonografi, CT, MRI, PET/CT dan biopsi aspirasi jarum halus (FNAB). Biasanya, biopsi aspirasi jarum halus yang dipandu ultrasound dianggap sebagai metode yang paling efektif untuk diagnosis pra operasi kanker tiroid, dengan sensitivitas yang dilaporkan sebesar 93% dan spesifisitas 75% [3]. Namun demikian, ada keterbatasan FNAB: sulit untuk mendapatkan jaringan lesi yang akurat bila nodul berdiameter kurang dari 1 cm; jumlah sel atau jaringan terbatas; dan ini merupakan tes invasif. Hanya 20%-25% temuan patologis pasca operasi pada pasien dengan lesi ganas yang tidak pasti atau dicurigai adalah kanker tiroid, dan 75%-80% pasien lainnya menjalani operasi tiroid yang tidak perlu [4]. Diagnosis dini DTC dengan cara non-invasif selalu menjadi hotspot klinis dan tantangan. Dalam beberapa tahun terakhir, banyak penelitian telah berusaha untuk meningkatkan diagnosis dini DTC dengan mendeteksi perubahan spesifik dalam ekspresi protein dalam serum pasien DTC untuk menemukan penanda tumor DTC, dan beberapa temuan ini telah menunjukkan harapan yang baik untuk aplikasi.
1. Studi proteomik serum bebas target dari kanker tiroid yang dibedakan
Banyak penelitian telah menemukan ekspresi gen abnormal pada DTC, termasuk mutasi BRAFV600E, penataan ulang gen RET/PTC1, mutasi RAS dan TRK pada karsinoma papiler [5]; mutasi NRASQ61R, mutasi BRAFK601E, penataan ulang PAX8/PPARG, mutasi RAS dan penataan ulang gen RET/PTC pada karsinoma folikuler [6]. dll [6]. Gen-gen yang bermutasi ini tidak hanya menyebabkan kelainan pada protein yang dikodekan, tetapi juga dapat menyebabkan perubahan dalam aktivitas jalur pensinyalan terkait di bagian hilir, secara langsung atau tidak langsung memengaruhi terjemahan dan modifikasi pemrosesan pasca-translasi dari protein terkait jalur. Menemukan dan menganalisis perbedaan protein tumor memiliki potensi untuk mengidentifikasi penanda tumor spesifik DTC. Teknik proteomik umum yang saat ini tersedia adalah spektrometri massa time-of-flight laser desorpsi/ionisasi laser berbantuan matriks (MALDI-TOF-MS), spektrometri massa time-of-flight laser desorpsi/ionisasi laser yang disempurnakan permukaan (SALDI-TOF-MS), dan spektrometri massa time-of-flight laser desorpsi/ionisasi laser yang ditingkatkan permukaan (SALDI-TOF-MS). spektrometri massa (SELDI-TOF-MS), dan spektrometri massa time-of-flight desorpsi laser/ionisasi yang disempurnakan permukaan (SELDI-TOF-MS).
Sofiadis A[7] (2010) dan Becker S[8] (2012) menggunakan SELDI-TOF-MS dan elektroforesis gel dua dimensi untuk menganalisis perbedaan ekspresi protein antara sampel jaringan DTC dan sampel kontrol, masing-masing, sebagai model untuk diagnosis DTC. Namun, perbedaan protein dalam jaringan tidak setara dengan perbedaan protein dalam serum, sementara jumlah dan sifat jaringan yang diperoleh untuk diagnosis tumor dini bervariasi dan rentan terhadap hasil negatif palsu, oleh karena itu proteomik jaringan tidak cocok untuk diagnosis pra-operasi dini. Sampel serum berlimpah dan ekstraksi serum mudah dan cepat dalam praktik klinis. Protein serum berlimpah (60C80 mg/ml) dan beragam (ratusan spesies) [9]. Lu Xubo dkk [10] (2006) telah menemukan perbedaan unik dalam ekspresi protein serum pada masing-masing dari tiga kelompok kanker tiroid, nodul tiroid jinak dan individu yang sehat, dan bahwa model sidik jari protein serum dengan spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi dapat dibuat dengan menggunakan teknik proteomik serum. Hal ini menunjukkan bahwa serum proteomik mungkin lebih menguntungkan dalam diagnosis dini tumor karena kemampuannya untuk menganalisis perbedaan antara serum tumor dan lesi jinak.
Sejak laporan pertama penggunaan teknologi proteomik untuk menyaring penanda protein terkait serum pada kanker ovarium pada tahun 2002 [11], teknologi proteomik telah banyak digunakan dalam studi banyak tumor manusia, seperti kanker paru-paru [12], kanker pankreas [13], kanker ovarium [14], kanker payudara [15], kanker usus besar, dll [16]. Hingga saat ini, para peneliti domestik dan internasional telah menggunakan pendekatan proteomik untuk mempelajari spesimen serum dari pasien dengan kanker tiroid terdiferensiasi dan menyaring beberapa penanda protein serum potensial atau membentuk model profil protein serum dengan spesifisitas dan sensitivitas tinggi untuk diagnosis DTC.
1.1 Spektrometri massa time-of-flight ionisasi yang dipecahkan dengan laser berbantuan matriks (MALDI-TOF-MS)
MALDI-TOF-MS adalah teknik tradisional untuk pemisahan dan identifikasi protein. Hal ini didasarkan pada penggunaan laser berdenyut yang bersumber nitrogen untuk menyebabkan matriks menyerap energi laser, sehingga mengionisasi sampel peptida. Sampel peptida kemudian memasuki penganalisis massa, di mana ionisasi terjadi karena perbedaan rasio massa-ke-muatan, dan parameter yang relevan dari ion peptida dapat diukur: sidik jari massa peptida, label urutan peptida atau urutan asam amino parsial, dan akhirnya perangkat lunak yang sesuai digunakan untuk mencari database proteomik untuk identifikasi kualitatif atau analisis kuantitatif protein.
Andrew Martorella dkk [17] (2007) menggunakan analisis MALDI-TOF-MS untuk mengidentifikasi 98 peptida serum yang berbeda secara signifikan pada 27 kasus kanker tiroid dan 32 kasus serum untuk membentuk sidik jari peptida serum, dan model ini mampu mengidentifikasi perbedaan antara dua kelompok peptida serum dengan akurasi statistik yang tinggi. Namun, model peptida yang ditemukan secara eksperimental tidak mengalami eksperimen seleksi buta dan hasil eksperimen belum dikonfirmasi dan metode eksperimental perlu ditingkatkan. Seiring dengan kemajuan penelitian proteomik, teknik proteomik baru sedang dikembangkan, seperti spektrometri massa time-of-flight ionisasi laser-terlarut yang ditingkatkan permukaannya (SELDI-TOF-MS), yang, berbeda dengan MALDI-TOF-MS, memungkinkan penggunaan langsung sampel mentah yang belum diproses (mis. serum, jaringan, cairan tubuh, dll.) Untuk penyaringan protein berskala besar, ultra-mikro, throughput tinggi, dan sepenuhnya otomatis. Ini juga dapat digunakan dalam berbagai kombinasi profil protein untuk diagnosis dan studi penyakit terkait, dan saat ini banyak dipelajari dalam onkologi dasar dan klinis.
1.2 Spektrometri massa time-of-flight ionisasi laser-terpecahkan yang ditingkatkan permukaan (SELDI-TOF-MS)
SELDI-TOF-MS, juga dikenal sebagai sidik jari protein, terdiri atas 3 bagian: microarray protein, spektrometri massa time-of-flight dan perangkat lunak analisis. Tergantung pada lamanya penerbangan protein dengan rasio massa-ke-muatan yang berbeda dalam bidang instrumen, posisi kelompok protein yang diukur dalam peta tergantung pada waktu penerbangan dan disajikan dalam bentuk puncak, yang diplot oleh pemrosesan komputer untuk membentuk peta spektrometri massa, yang secara langsung menunjukkan berat molekul dan kandungan berbagai protein dalam sampel. Dengan membandingkan spektrum kelompok kelompok eksperimen dengan kelompok kontrol, dimungkinkan untuk mengidentifikasi dan menangkap protein yang relevan dengan penyakit tertentu.
Yuxia Fan et al [1] (2009) menggunakan SELDI-TOF-MS untuk menganalisis dan menyaring tiga puncak protein serum diferensial pada pasien dengan PTC dan lesi tiroid jinak: rantai haptoglobin a1 (9190 Da), apolipoprotein C-I (6631 Da), dan apolipoprotein C-III (6631 Da). Ekspresi tinggi rantai haptoglobin a1 dan ekspresi rendah apolipoprotein C-I dan apolipoprotein C-III digunakan sebagai model diagnostik PTC, dengan sensitivitas diagnostik 98%. Spesifisitasnya adalah 97%. Wang et al [18] (2006) dan William H et al [19] (2008) menggunakan metode yang sama untuk membangun model diagnostik tumor yang terdiri dari puncak protein diferensial. Teknik SELDI-TOF-MS dapat secara akurat menganalisis dan menyaring protein atau peptida yang berbeda antara tumor ganas dan tumor jinak serta serum normal, dan dapat mendeteksi perbedaan halus di antara keduanya; pada saat yang sama, serum dapat dikumpulkan dan diawetkan dengan mudah dan dalam jumlah yang cukup. Ini dapat digunakan untuk diagnosis dini tumor dan untuk menemukan penanda spesifik tumor. Namun, metode ini tidak memiliki protein target, pekerjaan pengukuran yang besar dan reproduktifitas hasil eksperimen yang buruk, yang belum divalidasi lebih lanjut.
Singkatnya, protein diferensial yang diperoleh dalam eksperimen di atas sangat bervariasi, dengan berbagai tingkat sensitivitas dan spesifisitas, dan data tersebut tidak dapat digunakan dalam aplikasi klinis. Alexander [20] (2009) mengirim 20 protein manusia rekombinan yang sangat murni ke 27 laboratorium penelitian proteomik berbasis kromatografi cair dan hanya 7 laboratorium yang melaporkan 20 protein dengan benar. Komposisi dan kuantitas protein atau peptida dalam serum berada dalam keadaan perubahan yang dinamis. Reproduksibilitas hasil eksperimen semacam itu buruk. Metode pendeteksian perbedaan protein dalam serum tanpa target tampaknya tidak berhasil.
2. Studi modifikasi glikosilasi protein abnormal pada kanker tiroid yang terdiferensiasi
Faktanya, studi proteomik tumor terdiri dari dua aspek utama: (i) proteomik ekspresi, yang berfokus pada penyaringan protein diferensial dalam hal kuantitas dan rasio massa-ke-muatan, dan membangun model diagnostik tumor. Proteomik fungsional berfokus pada studi tumorigenesis dan perkembangan pada tingkat struktur protein, fungsi dan mekanisme kerja. Oleh karena itu, perbedaan protein muncul tidak hanya dari perbedaan ekspresi kelimpahan, tetapi juga dalam modifikasi protein pasca-sintesis, termasuk fosforilasi, glikosilasi dan asetilasi [21]. Di antara mereka, modifikasi glikosilasi adalah salah satu modifikasi pasca-translasi protein yang paling penting dan paling banyak dipelajari dalam penelitian ilmiah.
Glikosilasi protein adalah penggabungan kovalen fragmen oligosakarida dan rantai samping asam amino bersama-sama, diikuti dengan pelipatan lebih lanjut rantai polipeptida dengan susunan asam amino tertentu untuk membentuk molekul protein dengan struktur spasial tertentu, yang merupakan salah satu modifikasi protein pasca-translasial yang penting. 2/3 dari protein dalam sel eukariotik terglikosilasi. Ada dua jenis utama glikosilasi protein: N-glikosilasi, di mana fragmen oligosakarida secara kovalen melekat pada rantai samping yang mengandung asparagin (Asn), umumnya terjadi pada protein di lingkungan ekstraseluler, termasuk protein membran, protein sekretori dan protein dalam cairan tubuh; dan O-glikosilasi, di mana fragmen oligosakarida melekat pada rantai samping yang mengandung residu serin (Ser) atau treonin (Thr) [ 22].
Glikosilasi protein terlibat dalam pengaturan banyak peristiwa fisiologis dan patologis dalam sel, seperti pertumbuhan sel, migrasi, diferensiasi dan metastasis tumor. Glikoprotein permukaan membran sel terletak di lapisan terluar sel dan berkomunikasi dengan lingkungan internal dan eksternal, berpartisipasi dalam banyak proses biologis penting seperti aktivasi reseptor dan transduksi sinyal [23]. Dua pertiga dari protein dalam sel eukariotik dimodifikasi glikosilasi, dan banyak reseptor permukaan sel milik glikoprotein, seperti EGFR, integrin dan TGFBR, yang semuanya N-glikosilasi [21].
Arcinas [24] pada tahun 2009 secara komparatif menganalisis profil ekspresi protein permukaan sel dan protein yang disekresikan dalam lima garis sel kanker tiroid manusia yang berbeda dan mengidentifikasi total 333 protein yang dimodifikasi glikosilasi. Dalam sebuah studi tentang garis sel kanker tiroid yang terdiferensiasi (TPC-1, FTC-133), lima protein – protein membran sel, botulin, molekul adhesi sel-1, glikoprotein trofoblas, dan rantai protein discoid integrin alpha-5 – diekspresikan secara eksklusif di DTC. Miyoshi et al [21] (2010) lebih lanjut menunjukkan bahwa dalam sel tumor yang dimodifikasi glikosilasi dari kanker tiroid terdiferensiasi glikosilasi-modifikasi transferase FUT8 secara signifikan diregulasi pada tahap awal dan GnT-V secara signifikan diregulasi pada tahap ekspresi selanjutnya.
Jelas dari penelitian di atas bahwa ada peningkatan glikosilasi protein histone tiroid. Studi saat ini juga menemukan bahwa pada pasien dengan karsinoma hepatoseluler (N-asetilglukosaminiltransferase V, GnT-V; N-asetilglukosaminiltransferase III, GnT-III; α1-6 inkhorn glikosiltransferase, α1-6FT)[25], kanker payudara (N-asetilglukosaminiltransferase V, GnT-V)[26] dan kanker prostat (protein manik pengikat B)[27]. Hidenori [28] mendeteksi ekspresi Galectin-3 dalam serum pasien dengan kanker tiroid. Studi modifikasi glikosilasi protein serum saat ini pada kanker tiroid terdiferensiasi dalam diagnosis dini relatif jarang, tetapi pendekatan ini masih menunjukkan beberapa janji dan memberikan ide-ide penelitian baru, misalnya, beberapa protein glikosilasi diferensial DTC dapat disaring dan dikombinasikan dengan tiroglobulin yang lebih spesifik sebagai model diagnostik, sehingga penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mempelajari modifikasi glikosilasi protein abnormal pada kanker tiroid terdiferensiasi.
Kesimpulan dan pandangan
Kesimpulannya, studi diagnostik awal serologi kanker tiroid terdiferensiasi masih dalam tahap percobaan. Studi proteomik serum bebas target memberikan ide penelitian yang sangat jelas, tetapi proteomik serum sejauh ini belum diterapkan pada diagnosis klinis awal kanker tiroid yang berbeda, karena alasan berikut: 1, Analisis yang cermat terhadap hasil tes serologis di atas menunjukkan bahwa protein diferensial yang diperoleh oleh lembaga penelitian yang berbeda sangat bervariasi, dan reproduktifitas data eksperimental buruk, membuat aplikasi klinis tidak mungkin dilakukan [20]. 99% protein serum terdiri atas 22 protein dengan berat molekul tinggi, seperti albumin, transferin dan globulin terkonjugasi; 1% sisanya terdiri atas ratusan protein dengan berat molekul rendah. Jumlah protein dalam serum beragam dan seringkali dinamis [9]. Pendekatan tradisional saat ini yang mencoba menemukan penanda tumor melalui serum/plasma yang tidak ditargetkan dengan kelimpahan peptida molekul kecil yang rendah, tampaknya tidak berhasil.3 Sebuah studi yang berpikiran tunggal tentang jumlah protein yang berubah. Perbedaan antara jaringan normal dan tumor akibat perubahan genetik tercermin dalam protein, tetapi perbedaan fungsional dalam protein muncul tidak hanya dari perbedaan ekspresi kelimpahan, tetapi lebih pada modifikasi pasca-sintesis protein, termasuk fosforilasi, glikosilasi, asetilasi, dll. Ini adalah langkah pertama dalam pengembangan modifikasi protein pada kanker tiroid yang terdiferensiasi, terutama dalam studi protein glikosilasi spesifik kanker tiroid yang terdiferensiasi, yang dapat dilihat dalam studi yang disebutkan di atas.