Meskipun banyak tes yang tersedia, tingkat diagnosis dini rendah, dengan beberapa literatur melaporkan bahwa hanya 28,2% orang yang didiagnosis secara definitif sebelum operasi, dan tingkat kesalahan diagnosis pra operasi adalah 69,4%. Penyakit-penyakit utama yang harus dibedakan meliputi apendisitis, limfadenitis mesenterika, tuberkulosis abdomen, keganasan usus, enteritis radiasi, leukoaraiosis, kolitis ulseratif, jejuno-ileitis ulseratif non-granulomatosa, enteropati iskemik, enteritis amuba dan penyakit radang panggul. Penekanan khusus harus diberikan pada diagnosis banding antara tuberkulosis usus, limfoma usus dan penyakit Crohn. Karena dua penyakit pertama juga mudah salah didiagnosis secara klinis dan pengobatannya bertentangan dengan penyakit Crohn, salah diagnosis dan salah diagnosis tidak hanya dapat menunda pengobatan, tetapi juga memperburuk penyakit dan menyebabkan konsekuensi serius yang tidak dapat dipulihkan. Selain itu, pasien dengan penyakit Crohn mungkin memiliki kombinasi tuberkulosis usus akibat malnutrisi kronis atau penggunaan obat imunosupresif, atau limfoma ganas akibat peradangan kronis dan efek samping obat. Oleh karena itu, tuberkulosis usus dan limfoma usus harus mendapat perhatian yang memadai dalam diagnosis dan pengobatan penyakit Crohn. Setiap pasien dengan penyakit Crohn harus secara rutin diskrining untuk tuberkulosis sebelum diagnosis definitif dibuat. Selain penilaian klinisi terhadap penyakit, radiografi dada dan berbagai tes laboratorium harus dilakukan, termasuk tes tuberkulin, reaksi rantai polimerase Mycobacterium tuberculosis (TB-PCR), dan tes spot sel-T untuk infeksi tuberkulosis (tes T-SPOT). Diferensiasi limfoma usus dari penyakit Crohn sangat bergantung pada pemeriksaan patologis, termasuk pengambilan sampel endoskopi atau pemeriksaan patologis spesimen yang dieksisi melalui pembedahan, dan pewarnaan imunohistokimia dapat memberikan pementasan yang jelas dan menginformasikan pengembangan rejimen kemoterapi. Diagnosis akhir penyakit Crohn tidak dapat dibuat tanpa patologi, yang biasanya ditandai dengan peradangan fokal dan tambal sulam kronis, fokus crypt yang tidak teratur dan pembentukan granuloma non-kasus. Namun, karena keterbatasan volume dan cakupan spesimen endoskopi, dalam banyak kasus spesimen patologis yang khas tidak tersedia dan oleh karena itu temuan patologis hanya dapat dilaporkan sebagai peradangan kronis.