Dalam beberapa tahun terakhir, seiring dengan berlanjutnya penelitian tentang teknologi rekayasa jaringan tulang untuk pengobatan cacat tulang, penelitian tentang sel benih tulang yang direkayasa jaringan, terutama sel progenitor endotel vaskular, juga telah diintensifkan. Makalah ini mengulas kemajuan penelitian tentang asal-usul, sifat biologis, mekanisme peningkatan neogenesis vaskular, peran dalam perbaikan tulang, pengobatan, dan aplikasi sel progenitor endotel vaskular.
Perbaikan tulang adalah aktivitas patofisiologis kompleks yang melibatkan berbagai sel dan matriks ekstraseluler, dan diatur oleh berbagai faktor pertumbuhan dan hormon. Dalam beberapa tahun terakhir, teknik rekayasa jaringan tulang telah menjadi fokus penelitian dalam perbaikan cacat tulang, dengan banyak penelitian yang berfokus pada pemilihan dan kultur sel benih. Sel progenitor endotel (EPC) pertama kali dilaporkan oleh Asahara pada tahun 1997. Penemuan ini memperbaharui teori tradisional angiogenesis pascakelahiran dan perbaikan kerusakan pembuluh darah, dan memberikan cara berpikir baru untuk pengobatan penyakit iskemik.
1. Asal usul EPC
Sekarang secara umum diterima bahwa EPC dan sel punca hematopoietik berasal dari sel punca yang sama, haemangio-gioblast. Meskipun definisi dan asal usul EPC masih kontroversial, sebagian besar penelitian menunjukkan bahwa EPC terutama berasal dari darah vena umbilikalis, darah perifer dewasa, dan sumsum tulang, dengan EPC dalam darah perifer yang berasal dari sumsum tulang dan EPC dalam darah umbilikalis yang berasal dari hati janin. Dalam kondisi normal, jumlah EPC sangat kecil, sekitar 2-3/mL dalam darah perifer dan sekitar 3,5 kali lebih tinggi dalam darah tali pusat. Mereka dapat berproliferasi dan berkembang dalam jumlah besar di bawah kondisi kultur yang cocok untuk pertumbuhan EPC, seperti faktor pertumbuhan endotelia vaskular (VEGF) dan faktor pertumbuhan fibroblast (FGF). Asahara et al [1] melaporkan bahwa EPCs adalah sekelompok sel dengan karakteristik mengembara, termasuk CD34, CD133, VEGF, Fibroblast growth factor (FGF), FGF, dll. Asahara et al[1] melaporkan bahwa EPC adalah sekelompok sel prekursor dengan karakteristik mengembara, positif untuk penanda permukaan seperti CD34, CD133 dan VEGFR-2+, yang dapat berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi sel endotel vaskular setelah kultur in vitro. Mereka tidak hanya terlibat dalam angiogenesis embrionik, tetapi juga ada dalam darah tali pusat, darah perifer dan sumsum tulang dan memiliki efek pro-angiogenik yang kuat selama angiogenesis pascakelahiran, dan membentuk EPC neovaskular dengan cara angiogenik.
2. Sifat biologis EPC
2.1 Penanda permukaan EPC
Tidak ada penanda permukaan yang spesifik untuk identifikasi EPC, tetapi sebagian besar ahli percaya bahwa sel CD34+ adalah sel progenitor umum dari sel induk hematopoietik dan sel progenitor endotel. MAPC) adalah sumber EPC. Sel ini dapat berdiferensiasi menjadi sel angiogenik CD34+, CD133+, VEGFR-2+ dan Flk1+ sebagai respons terhadap VEGF, FGF dan IGF-Ⅰ, dan dapat terus berdiferensiasi menjadi sel endotel vaskular yang matang, sehingga menjadikannya sumber penting sel endotel.
Studi awal mendefinisikan EPC sebagai sel yang mengekspresikan penanda permukaan sel induk hematopoietik CD34 dan penanda permukaan sel endotel vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2). Selanjutnya, Peichev dkk. menemukan bahwa antigen CD133 hanya terdapat pada sel prekursor endotel vaskular dan bahwa sel endotel dewasa tidak mengekspresikan CD133; oleh karena itu, mereka merujuk pada sel yang mengekspresikan CD34+, VEGFR-2+, dan CD133+ sebagai sel progenitor endotel vaskular fungsional. Namun, beberapa penulis telah mengusulkan pandangan yang berbeda. Harraz dkk. menemukan selama percobaan mereka bahwa sel CD34- secara bertahap berdiferensiasi menjadi sel endotel dalam kultur yang dikondisikan (kultur di mana sel CD34 + telah dikultur), dan oleh karena itu menyimpulkan bahwa sel CD34 + mengeluarkan faktor tertentu yang tidak diketahui untuk merangsang diferensiasi sel CD34- menuju sel endotel.
Rehman dkk. melaporkan bahwa MSC sumsum tulang dan monosit CD34-CD14+ juga dapat membentuk sel endotel vaskular fungsional secara in vitro setelah diinduksi oleh VEGF dan faktor lainnya. Diferensiasi sel endotel yang diinduksi dari makrofag mononuklear juga telah dilaporkan.
2.2 Mobilisasi EPC
Mobilisasi sel progenitor dalam sumsum tulang ditentukan oleh lingkungan setempat. Mobilisasi sitokin seperti elastase, histone G dan keluarga matriks protease (MMP) menghambat interaksi antara sel punca dan sel stroma dengan menghilangkan ikatan adhesi pada sel stroma, dengan aksi integrin sel punca hematopoietik, yang pada akhirnya memungkinkan sel punca meninggalkan sumsum tulang melalui migrasi transendotelial.
Secara fisiologis, diperkirakan bahwa iskemia dapat menjadi sinyal untuk menginduksi mobilisasi EPC sumsum tulang. Dengan demikian, iskemia dapat meregulasi VEGF dan melepaskannya ke dalam sirkulasi dan menginduksi mobilisasi sel prekursor sumsum tulang melalui ketergantungan MMP-9. Dalam hematologi, faktor-faktor lain telah diidentifikasi termasuk mobilisasi sel punca sumsum tulang, seperti pemanenan sel punca hematopoietik dari darah perifer untuk transplantasi sumsum tulang. Selain itu, eritropoietin (EPO) menstimulasi proliferasi dan pematangan eritrosit dan, pada tikus dan manusia, meningkatkan jumlah sel progenitor endotel dalam darah perifer. Hubungan antara kadar EPO serum dan sel punca CD34+ atau CD133+ di sumsum tulang pasien dengan penyakit jantung iskemik mendukung peran penting untuk kadar EPO endogen sebagai indikator fisiologis mobilisasi EPC.
Namun, tidak jelas faktor mobilisasi mana yang paling penting untuk meningkatkan EPC. Dalam penelitian pada hewan, VEGF165 dengan cepat memobilisasi sel punca hematopoietik dan sel progenitor endotel yang bersirkulasi, sedangkan angiopoietin-1 (ANG-1) menginduksi mobilisasi sel progenitor endotel dan hematopoietik yang tertunda dan lebih lemah. Selain itu, bukti pertama untuk modulasi farmakologis tingkat EPCs diberikan oleh penelitian dengan obat ateroprotektif MG-CoA reductase inhibitor (statin).
Penelitian telah menunjukkan bahwa statin meningkatkan jumlah dan aktivitas fungsional EPC pada tikus dan pasien dengan penyakit arteri koroner yang stabil secara in vitro. Statin dapat meningkatkan jumlah sel punca di sumsum tulang, meningkatkan jumlah EPCs dan meningkatkan fungsi EPCs termasuk proliferasi EPCs, mobilisasi EPCs dan pencegahan penuaan dan apoptosis EPCs.
2.3 Diferensiasi EPC
Koyanagi dkk. menemukan bahwa calmodulin E dan N diekspresikan pada permukaan kontak EPCs-kardiomiosit dalam sistem ko-kultur, dan bahwa pemblokiran calmodulin E menghambat transdiferensiasi EPC, yang mengindikasikan efek interaksi antar sel pada transdiferensiasi EPCs. Demikian pula, gagasan transdiferensiasi menjadi kardiomiosit baru-baru ini dipertanyakan, karena Sales dkk. menunjukkan bahwa EPC yang diinduksi oleh TGF-ß1 secara in vitro selama 10-15 d dapat berubah dari fenotipe endotel (CD31+/vWF+/αSMA-) menjadi fenotipe mesenkim (CD31+/α-SMA+), sambil mensekresi laminin, fibronektin dan kolagen tipe I dan III. Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi bahwa EPCs ditransdiferensiasi untuk membentuk MSCs dan bukan berasal dari sel prekursor MSC yang mungkin dicampur dengan EPCs atau dengan mekanisme fusi sel. EPC mengekspresikan penanda sel otot polos yang lebih tinggi daripada sel endotel dewasa dan diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi sel otot polos dengan fenotipe yang berbeda (kontraktil atau sintetis) oleh PDGF-BB, menunjukkan bahwa mereka juga dapat berdiferensiasi menjadi sel otot polos vaskular.
Semua penelitian ini menunjukkan bahwa nasib EPCs tidak selalu linier, tetapi dapat mengikuti jalur diferensiasi lain dalam kondisi tertentu, yang berarti bahwa “keadaan EPCs” yang dimiliki oleh sel yang berbeda bersifat dinamis dan tidak stabil, dan dapat berubah menjadi keadaan sel progenitor batang (progenitor) lainnya di bawah pengaruh faktor lingkungan eksternal, dan berdiferensiasi menjadi EPC bersifat dinamis dan tidak stabil.
3. Peran EPC dalam perbaikan tulang
3.1 Mekanisme yang digunakan EPC untuk meningkatkan angiogenesis
Meskipun peran EPCs dalam angiogenesis telah ditunjukkan, pertanyaannya tetap mengenai bagaimana EPCs mempromosikan angiogenesis. Dengan tidak adanya cedera jaringan, peran sel progenitor lemah, tetapi dalam jaringan iskemik, sel-sel yang diturunkan dari sumsum tulang yang dilabeli secara genetik dapat mengekspresikan protein penanda untuk EC dengan variasi yang luas dalam efeknya (mulai dari 0% hingga 90%). Demikian pula, apa peran sel yang berasal dari sumsum tulang dalam jaringan otak pasca-stroke? Laporan dalam literatur sangat bervariasi.
Dalam dua penelitian, satu menghasilkan rata-rata 34% sel positif yang berasal dari sumsum tulang yang mengekspresikan penanda endotel, sementara yang lain gagal mendeteksi sel yang mengekspresikan penanda endotel, dengan sejumlah besar (50%) terdeteksi terutama dalam model angiogenesis tumor. Beberapa penelitian hanya mendeteksi sel-sel yang berasal dari sumsum tulang di sekitar pembuluh darah, tetapi tidak mengekspresikan protein penanda endotel. Salah satu penjelasan yang mungkin adalah bahwa model iskemia (misalnya tingkat cedera atau iskemia) secara signifikan mempengaruhi peran sel-sel ini. Iskemia ringan mungkin hampir tidak menginduksi mobilisasi sel progenitor endotel, tetapi hanya sejumlah kecil sel progenitor sumsum tulang yang diinduksi untuk bertindak. Efek transplantasi sel juga dapat bervariasi, tergantung pada subpopulasi sel (misalnya, sel punca hematopoietik murni versus sel sumsum tulang). Memang, infus intravena sel mononuklear sumsum tulang yang dimurnikan atau sel progenitor endotel yang diperluas menghasilkan hasil yang lebih baik daripada mobilisasi internal sel transplantasi sumsum tulang.
Sel-sel yang berasal dari sumsum tulang yang positif Tie-2 dapat memblokir angiogenesis tumor dengan mengaktifkan gen bunuh diri, dan meskipun sel-sel ini berintegrasi ke dalam pembuluh darah tumor, mereka dapat dideteksi di sekitar pembuluh darah. Dengan demikian, EPC dapat bertindak serupa dengan monosit atau makrofag karena mereka dapat meningkatkan angiogenesis dengan menyediakan sitokin dan faktor pertumbuhan. Penelitian telah menunjukkan bahwa EPC yang dikultur dari asal yang berbeda dapat mengekspresikan faktor pertumbuhan seperti VEGF, HGF dan IGF-1. Monosit yang melekat dapat dikultur dalam kondisi yang sama dan melepaskan VEGF, HGF dan G-CSF, tetapi tidak dapat mengekspresikan protein penanda endotel; EPC dapat dimasukkan ke dalam struktur neovaskulatur, menunjukkan bahwa mereka terlibat dalam ekspresi protein penanda endotel secara in vivo; sedangkan makrofag, yang juga dapat melepaskan faktor pertumbuhan tetapi tidak dapat dimasukkan ke dalam struktur pembuluh darah, hanya dapat menginduksi peningkatan kecil dalam neovaskularisasi jaringan pasca-ischaemic. Peningkatan kecil dalam neovaskularisasi jaringan pasca-iskemik diinduksi.
Studi di atas tidak mengkonfirmasi kemampuan EPC untuk berpartisipasi dalam pembentukan struktur seperti vaskular secara in vivo, tetapi mereka meningkatkan neovaskularisasi vaskular.
3.2 Peran EPC dalam perbaikan tulang
EPC mungkin terlibat dalam neovaskularisasi dan pembaharuan sel endotel melalui mekanisme seperti integrasi, fusi dan sekresi parakrin, dan bertindak sebagai sel benih dalam rekayasa jaringan untuk mempromosikan vaskularisasi in vivo dari tulang rekayasa jaringan. Tiga proses dasar setelah pencangkokan tulang adalah vaskularisasi cangkok, regenerasi tulang, dan fusi ujung tulang, di mana vaskularisasi adalah komponen kunci, yang bekerja selama proses perbaikan cangkok dan menentukan mode dan efek regenerasi dan fusi tulang. Setelah konstruksi in vitro tulang rekayasa jaringan, terutama dalam volume besar, suplai darah yang memadai harus cepat terbentuk untuk membawa sel prekursor osteoblas, faktor terkait, nutrisi dan sel lain yang terlibat dalam perbaikan tulang ke dalam lingkungan mikro lokal dan untuk membawa limbah metabolisme dan nekrosis dan produk dekomposisi, menyediakan nutrisi untuk kelangsungan hidup dan perkembangan sel benih dan mempertahankan lingkungan fisiologis yang kondusif untuk proses ini secara keseluruhan. Lingkungan mikro metabolik dipertahankan secara keseluruhan untuk memfasilitasi proses fisiologis ini.
Pendekatan dasar untuk rekayasa jaringan tulang adalah dengan menginokulasi sel benih dengan biomaterial yang dapat diserap untuk membentuk kompleks perancah sel untuk implantasi ke dalam tubuh. Ketika bahan perancah terdegradasi, sel benih terus berproliferasi dan berdiferensiasi, mensekresikan matriks dan melepaskan sitokin, sehingga mempercepat perbaikan cacat tulang. Saat ini, ada banyak penelitian untuk mempromosikan vaskularisasi in vivo dari tulang rekayasa jaringan. Yang umum termasuk: metode bundel vaskular yang dibungkus, enkapsulasi otot yang telah dikonstruksi sebelumnya dengan ujung vaskular, metode pembungkus fasia ujung vaskular, komposit sel progenitor endotel vaskular atau sel endotel vaskular, serta modifikasi struktural 3D dari bahan perancah untuk memfasilitasi vaskularisasi dan transfeksi gen dan teknik pelepasan lambat / terkontrol dari faktor bioaktif pro-angiogenik. Penggunaan mobilisasi faktor perangsang koloni granulosit telah terbukti efektif dalam meningkatkan jumlah EPC yang bersirkulasi dan meningkatkan endotelisasi bahan implan buatan. Penelitian juga menunjukkan bahwa EPC dapat digunakan sebagai sel benih dalam rekayasa jaringan untuk mempromosikan vaskularisasi in vivo dari tulang rekayasa jaringan dan mempromosikan perbaikan tulang.
3.3 EPC dalam perbaikan tulang untuk pengobatan dan aplikasi
Rekayasa jaringan secara sederhana adalah kultivasi in vitro dari sel-sel yang relevan secara fungsional yang ditumbuhkan pada perancah alami atau sintetis untuk mendapatkan jaringan dan organ fungsional baru, tetapi sebagian besar jaringan dan organ memerlukan jaringan mikrovaskular untuk memasok nutrisi dan membawa metabolit.
Schmidt dkk. mengisolasi dan mengkultur sel progenitor endotel dari darah tali pusat manusia dan menginokulasikannya bersama dengan sel otot polos pembuluh darah manusia ke dalam perancah dan menemukan bahwa sel tersebut dapat membentuk struktur seperti kapiler dalam kopolimer asam polilaktat asam poliglikolat. Schultheiss et al. membangun kandung kemih rekayasa jaringan dengan menginokulasi sel otot polos dan sel epitel kandung kemih dengan segmen usus halus babi yang didekelularisasi yang mempertahankan struktur vaskularnya. Dalam bidang penting penelitian rekayasa jaringan, penelitian rekayasa jaringan tulang telah memberikan hasil yang menarik di beberapa bidang dan telah digunakan dalam aplikasi klinis awal, dan dianggap sebagai salah satu bidang rekayasa jaringan yang paling menjanjikan dan layak.
Studi eksperimental ini menunjukkan bahwa penggunaan sel progenitor endotel vaskular untuk membangun tulang rekayasa jaringan cukup menjanjikan dan memiliki potensi besar untuk pengobatan cacat tulang segmen panjang.
4. Kesimpulan dan prospek
Sel progenitor endotel vaskular memiliki aplikasi yang sangat menjanjikan di bidang rekayasa jaringan, tetapi penelitian baru saja dimulai dan masih banyak masalah yang harus diselesaikan, seperti penanda permukaan dan sistem kultur yang optimal. Dipercaya bahwa penelitian di masa depan akan mengarah pada terobosan dalam fenotipe vaskular, peran dalam remodelling jaringan dan sifat biologisnya, dan dalam penerapan sel-sel ini untuk meningkatkan efisiensi terapeutik dan mengurangi efek samping. Sebagai anggota sel benih rekayasa jaringan, EPC telah menunjukkan potensi besar untuk aplikasi klinis dalam pengobatan regeneratif dengan munculnya terapi sel autologus dan konsep modifikasi gen.