Waktu terbaik untuk melakukan amniosentesis adalah antara usia kehamilan 16-20 minggu. Cairan ketuban sebagian besar dibentuk oleh urin janin. Sebelum usia kehamilan 16 minggu, fungsi kandung kemih janin belum berkembang dengan baik dan jumlah cairan ketuban relatif sedikit. Setelah usia kehamilan 20 minggu, janin akan berkembang lebih cepat, ukuran janin relatif besar dan ruang untuk tusukan relatif terbatas. Amniosentesis terakhir tidak boleh melebihi usia kehamilan 24 minggu, karena jumlah sel dalam cairan ketuban setelah usia kehamilan 24 minggu relatif rendah, dan setelah amniosentesis dilakukan, dibutuhkan waktu yang lebih lama untuk dikultur, dan jika usia kehamilan minggu tusukannya relatif besar, maka akan mengganggu langkah diagnosis prenatal selanjutnya. Sel-sel yang diekstraksi dari cairan ketuban akan membutuhkan waktu sekitar 2-3 minggu untuk dikultur, dan ada beberapa kasus di mana kultur sel mungkin gagal, sehingga membutuhkan tusukan kedua jika perlu. Jika waktu optimal untuk amniosentesis terlewatkan, tusukan darah tali pusat dapat dilakukan di kemudian hari dalam kehamilan untuk diagnosis prenatal.