Infertilitas dan perawakan pendek adalah dua masalah utama bagi orang dengan sindrom Turner (TS). Dalam 20 tahun terakhir, hormon pertumbuhan rekombinan (Groeth Hormorn, GH) telah digunakan untuk mengobati stunting, sehingga memungkinkan sebagian besar orang dengan TS mencapai tinggi badan orang dewasa pada atau sedikit di bawah batas bawah populasi normal. Karena kegagalan ovarium prematur adalah gejala klasik dari kondisi ini, menerima donasi sel telur dan mengawetkan sel telur yang tersisa telah menjadi salah satu pengobatan yang efektif untuk infertilitas.
Antara 15-30% pasien TS mengalami pubertas spontan, tetapi hanya 2-5% dari mereka yang mengalami primiparitas yang dapat hamil, yang menunjukkan bahwa folikel pada pasien TS memiliki produksi estrogen tetapi menghilang sebelum waktunya dan bahwa proses hilangnya yang dinamis belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Dalam penelitian sebelumnya, jaringan korteks ovarium dibiopsi, dibekukan, dan dianalisis untuk mencari folikel pada anak perempuan dengan TS, dan folikel ditemukan ada pada 8 dari 10 remaja perempuan. Saat ini, kriopreservasi jaringan korteks ovarium sebelum pengobatan antikanker pada pasien onkologi wanita muda dengan persyaratan kesuburan telah digunakan sebagai pilihan untuk mengawetkan folikel primordial untuk pengobatan infertilitas di masa depan, dan keturunan yang sehat telah diperoleh dari transplantasi jaringan ovarium yang dibekukan dan dicairkan.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memprediksi kesuburan pasien TS dengan membekukan jaringan ovarium dan menilainya secara klinis dan hormonal, termasuk usia, kariotipe, menstruasi spontan, hormon perangsang folikel pubertas (FSH), hormon luteinizing (LH) dan kadar hormon anti-milenia yang diturunkan dari granulosit (AMH).
Data klinis
Penelitian ini melibatkan 57 pasien dengan TS, berusia 8-19,8 tahun, yang dirujuk oleh 25 ahli endokrinologi pediatrik di Swedia (terutama Stockholm dan Skåne di bagian selatan), dan pasien serta orang tua mereka diberitahu mengenai detail penelitian dan menandatangani formulir persetujuan. Pasien dan keluarga diberitahu secara rinci bahwa tidak mungkin untuk memprediksi apakah jaringan ovarium yang diperoleh akan mengandung sel telur untuk pengobatan infertilitas di masa depan, dan bahwa ada pilihan lain untuk memulai sebuah keluarga, seperti donor sel telur dan adopsi, dan sebagian besar keluarga menerima proposal tersebut dan mengikuti penelitian ini.
Hanya 15 orang di pusat medis dengan jumlah pasien terbanyak yang menolak untuk bergabung. Kami percaya bahwa pasien dengan tanda-tanda kegagalan ovarium prematur juga cenderung menemukan folikel, sehingga tidak ada pasien yang ditolak untuk berpartisipasi. Penelitian ini telah disetujui oleh Komite Etik Institut Karolinska dan dilakukan sesuai dengan Deklarasi Helsinki dan hukum Swedia tentang etika penelitian medis.
Tidak termasuk tujuh anak perempuan yang berusia di bawah 12 tahun, 19 dari 50 anak perempuan memiliki tanda-tanda awal pubertas spontan, 13 (26%) menunjukkan menarche dan 21 menjalani HRT. belum ada penelitian yang mengkonfirmasi volume ovarium minimum yang dapat mendeteksi folikel, sehingga tidak ada USG atau pencitraan resonansi magnetik (MRI) yang dilakukan sebelum melakukan penelitian. Pasien menerima hormon pertumbuhan manusia (GH), tiroksin (T4) dan terapi penggantian hormon estrogen (HRT) sesuai dengan protokol pengobatan Swedia.
Analisis kromosom limfosit menentukan diagnosis TS, yaitu 45X pada 28 kasus, chimeric pada 7 kasus (45X/46XX/47XXX) dan kelainan struktural (SA) pada salah satu kromosom X pada 22 kasus lainnya, termasuk delesi lengan panjang atau pendek, heterokromosom, kromosom cincin, atau fragmen Y. Hasil analisis kromosom disediakan oleh pusat medis tempat pasien diperiksa, dan jumlah sel yang dianalisis berkisar antara 15-105, tergantung pada waktu dan tempat pengujian.
Tingkat kerincian dalam laporan laboratorium genetik juga bervariasi, dengan beberapa laporan bahkan tidak memiliki informasi terperinci tentang tidak adanya atau duplikasi lengan kromosom X. Semua hasil analisis kromosom berasal dari kultur limfosit, dan beberapa analisis hibridisasi fluoresensi in situ (FISH) dari sel mukosa bukal atau jaringan lain juga dilaporkan.
Metode
Laparoskopi
Pasien menjalani biopsi laparoskopi dengan anestesi umum untuk mendapatkan jaringan ovarium untuk dibekukan. 10 orang perempuan memiliki ovarium yang terlalu lurik atau terlalu kecil untuk dibiopsi atau bahkan sulit untuk diidentifikasi. Pada 47 pasien lainnya, 25-50% jaringan kortikal dari satu ovarium dibiopsi.
Kriopreservasi
Jaringan ovarium yang telah dipotong segera ditempatkan dalam kultur fertilisasi in vitro yang mengandung buffer HEPES dan albumin serum manusia. 0,5-3 mm3 korteks ovarium dipotong untuk biopsi histologis dan jaringan yang tersisa dipotong kecil-kecil, sekitar 0,5 x 3-5 mm, dan dibekukan dengan pemrograman lambat dengan krioprotektan propilen glikol sukrosa.
Biopsi histologis dan penghitungan folikel
Sepotong kecil jaringan ovarium segar dari setiap pasien dipotong dan difiksasi dalam larutan Bouin, ditanamkan dalam parafin, dibelah dan diwarnai dengan hematoksilin dan eosin. Jumlah total folikel dan kepadatan folikel dari spesimen yang dibiopsi dinilai dengan menggunakan sistem analisis pencitraan data yang terhubung ke mikroskop terbalik. Kepadatan folikel dinyatakan sebagai jumlah folikel per milimeter kubik dalam sampel yang dianalisis, dan hanya folikel normal yang dihitung. Biasanya kepadatan folikel pada anak perempuan yang sehat lebih besar dari 500/mm3.
Pengukuran hormon
Sampel darah untuk FSH, LH dan AMH diambil sehari sebelum biopsi laparoskopi pada 28 kasus, 19 sampel darah dikirim dalam waktu satu tahun setelah biopsi dan 10 kasus lainnya tidak memiliki sampel darah.
Serum FSH dan LH diukur pada 47 pasien, 43 pasien dengan immunoassay chemiluminescent dua tempat fase padat (Immulite) di Laboratorium Penelitian Kesehatan Wanita di Institut Karolinska. LH, prolaktin, GH manusia atau laktogen plasenta manusia (HPL) tanpa reaktivitas silang yang dapat dideteksi.
Sensitivitas analisis LH adalah 0,1 mIU/ml dan spesifisitasnya juga sangat tinggi, tanpa reaktivitas silang yang dapat dideteksi dengan hCG, FSH atau TSH. Sensitivitas tes FSH adalah 0,7 mIU / ml, dengan tingkat kritis yang banyak digunakan di Eropa, sesuai dengan konsentrasi 17 IU / L. Standar yang banyak digunakan di AS dikalibrasi sesuai dengan Persiapan Referensi Internasional Kedua (IRP) untuk tes biologis FSH dan hCG WHO. Ini dikalibrasi dengan standar IRP kedua.
Konsentrasi AMH ditentukan dalam 43 serum anak di Laboratorium Penelitian Kesehatan Wanita, Institut Karolinska, Swedia, dengan menggunakan kit ELISA AMH dua langkah. Protokol ultra-sensitif yang direkomendasikan oleh produsen digunakan. Metode ini memiliki spesifisitas yang sangat tinggi untuk deteksi AMH dan tidak ada reaktivitas silang dengan TGF-β. Sensitivitas didefinisikan sebagai konsentrasi AMH terendah yang secara signifikan berbeda dari standar nol dengan probabilitas 95% menjadi 0,7 pmol / L.
Statistik
Sensitivitas dan spesifisitas tes diagnostik digunakan untuk menghitung nilai prediktif positif dan negatif. Nilai prediktif positif adalah proporsi pasien dengan hasil tes positif dan mencerminkan sensitivitas tes. Nilai prediktif negatif adalah proporsi non-pasien dengan hasil tes negatif dan mencerminkan spesifisitas tes. Hasil dinyatakan sebagai kurva ROC (kurva karakteristik operasi penerima) dan diproses secara statistik menggunakan uji χ2, dengan P<0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik.
Hasil
Laparoskopi
Seluruh 57 laparoskopi merupakan prosedur rawat jalan, yaitu pasien masuk di pagi hari dan keluar di sore atau malam hari, dan tidak ada komplikasi anestesi atau pembedahan dalam penelitian ini.
LH, FSH dan AMH
Semua pasien dibiopsi tanpa HRT pada 36 kasus dan HRT diberikan pada 21 kasus. Pengukuran hormon tidak dilakukan karena adanya artefak pengukuran hCG. LH dan FSH diukur pada 30 kasus. 17 kasus memiliki nilai serum LH dan/atau FSH yang lebih tinggi dari normal untuk usia mereka, di mana 13 di antaranya tidak ditemukan folikel pada spesimen biopsi dan 4 sisanya memiliki folikel; 13 kasus memiliki nilai hormon dalam kisaran normal untuk usia mereka, di mana 9 di antaranya ditemukan folikel dan 4 lainnya tidak memiliki folikel.
Ovarium dengan sel telur
Dari 57 pasien, 47 dapat dibiopsi pada satu ovarium dan 15 (26% dari total) memiliki folikel berkisar antara 0,7-1200/mm3. 6 dari 7 chimera (86%) memiliki folikel yang terlihat, 6 dari 22 SA (27%) memiliki folikel, dan 3 dari 28 kariotipe 45X (10,7%) memiliki folikel. 19 pasien dengan ciri-ciri pubertas spontan Sebelas (58%) dari 19 pasien dengan pubertas spontan memiliki folikel dan delapan (62%) dari 13 periode menstruasi spontan memiliki folikel.
Dari 30 pasien yang berusia lebih dari 12 tahun tanpa ciri-ciri pubertas spontan, tiga (10%) ditemukan memiliki folikel. Seorang anak perempuan berusia 11 tahun ditemukan memiliki folikel meskipun tidak ada tanda-tanda pubertas yang jelas.
Lima prediktor positif (sensitivitas) teratas untuk memprediksi keberadaan folikel adalah: kariotipe sebagai chimeric (0,86), nilai FSH 11 mIU / ml (0,69), AMH2 pmol / L (0,64), menarche spontan (0,62), dan onset pubertas spontan (0,58).
Nilai prediksi negatif (spesifisitas) untuk tidak adanya folikel adalah: kariotipe 45X (0,89), AMH2 pmol/L (0,88), tidak adanya onset pubertas spontan (0,87), usia kurang dari 12 tahun (0,82), tidak adanya menarke spontan (0,81), nilai FSH 15 mIU/ml (0,77), usia lebih dari 16 tahun (0,76), kariotipe SA (0,73). ). Lima dari enam faktor di atas signifikan secara statistik, dengan faktor usia tidak signifikan, meskipun nilai prediktif negatif lebih tinggi pada kelompok usia termuda.
Kesimpulan
Hasil penelitian ini menunjukkan 5 faktor penting untuk kemampuan mendeteksi folikel di ovarium anak perempuan TS: kariotipe, FSH rendah, AMH tinggi, menarche spontan, dan pubertas spontan. Sebagai kesimpulan, kelompok anak perempuan dengan TS berikut ini memiliki peluang tertinggi untuk memiliki folikel dan dapat dipertimbangkan untuk dilakukan biopsi laparoskopi jaringan ovarium untuk pembekuan antara usia 13-17 tahun: 1) kembar (45X/46XX/47XXX); 2) dengan pubertas spontan dan 45X atau 45X/46X+ SA; dan 3) dengan FSH dan/atau AMH serum normal dengan atau tanpa pubertas spontan.
Dengan asumsi bahwa 3 kriteria di atas digunakan untuk memprediksi pasien dalam penelitian ini, 19 kasus seharusnya menjalani laparoskopi pada usia yang sama, di mana 11 di antaranya memiliki folikel yang dapat dideteksi dan 8 tidak memiliki folikel, dengan sensitivitas 0,58 (9/11). 15 dari pasien yang lebih muda, penundaan laparoskopi berarti masih ada 2 kasus di mana folikel masih dapat dideteksi kemudian, karena keduanya memiliki ciri-ciri pubertas. 23 pasien yang tidak menjalani laparoskopi, 2 kasus dengan folikel dapat dideteksi kemudian, karena keduanya memiliki ciri-ciri pubertas. 2 kasus dengan folikel bisa saja terlewatkan berdasarkan kriteria ketiga. Spesifisitas untuk mengecualikan anak perempuan dengan TS tanpa folikel seharusnya adalah 0,91 (21/23).
Diskusi
Tidak mengherankan bahwa folikel dapat ditemukan pada sebagian besar pasien TS dengan pubertas spontan dan chimerisme. Di luar dugaan, folikel juga ditemukan pada tiga pasien tanpa pubertas spontan dan pada empat pasien dengan FSH, LH, dan AMH yang tinggi. Proses atresia folikel dan peningkatan konsentrasi gonadotropin dalam ovarium tampaknya terjadi pada periode yang tumpang tindih, setidaknya pada beberapa individu, dan tiga kasus dengan folikel setidaknya memiliki fungsi ovarium tetapi tidak menunjukkan tanda-tanda pubertas, menyiratkan bahwa folikel kecil mereka tidak dapat mensekresikan jumlah estrogen yang cukup untuk memicu timbulnya pubertas.
Di sisi lain, dua pasien dengan serum gonadotropin normal dan AMH>2 pmol/liter tidak menunjukkan folikel, sehingga ada kemungkinan bahwa folikel tidak ada dalam spesimen kecil yang mereka gunakan untuk analisis histologis, tetapi ada dalam jaringan ovarium beku atau bagian lain dari ovarium, yang diketahui tidak konsisten dalam distribusinya di dalam ovarium. Demikian pula, tidak ada folikel yang terlihat pada empat kasus dengan kadar gonadotropin normal dan pada empat kasus dengan kadar AMH yang tinggi.
Ultrasonografi atau MRI panggul tidak diperlukan untuk memastikan ada atau tidaknya ovarium sebelum laparoskopi dilakukan dalam penelitian ini. Beberapa perempuan telah menjalani eksplorasi USG transabdominal di rumah sakit setempat, tetapi hasil dan kesesuaiannya dengan temuan laparoskopi sangat minim.
Penelitian sebelumnya juga menunjukkan bahwa temuan USG transabdominal dapat diandalkan, sehubungan dengan minat khusus dari penyelidik, pelatihan keterampilan spesialis dan peralatan yang baik. MRI mungkin merupakan metode yang lebih baik untuk mendeteksi jaringan ovarium dalam praktik klinis dan dapat menjadi pilihan jika biopsi ovarium laparoskopi tidak sesuai dengan kriteria di atas pada pasien. 2 kasus dalam penelitian ini di mana folikel terlewatkan karena tidak memenuhi kriteria di atas mungkin didiagnosis dengan MRI.
Perlu dipertimbangkan apakah perlu melakukan biopsi ketika seorang gadis dengan TS mencapai usia 13 atau 14 tahun, meskipun secara statistik tidak ada perbedaan yang signifikan antara usia dan kemampuan untuk mendeteksi folikel. Sebagian besar pasien yang mencapai usia ini telah memahami kemungkinan dan keterbatasan pengawetan jaringan ovarium untuk masa depan, dan karena pengalaman dengan sel yang disimpan untuk perawatan kesuburan masih terbatas, maka perlu diinformasikan kepada pasien bahwa tidak ada jaminan bahwa mereka akan memiliki keturunan biologis di masa depan.
Karena kehamilan pada pasien dengan TS dapat meningkatkan risiko komplikasi, maka hal ini harus didiskusikan dengan pasien dan orang tuanya, dan ia harus diberitahu bahwa kehamilannya akan memerlukan pemantauan khusus oleh dokter kandungan. Wanita dengan kelainan jantung (insufisiensi aorta atau stenosis aorta) atau hipertensi memiliki risiko lebih tinggi untuk mengalami aneurisma koarktasio aorta yang fatal, tetapi masih diperlukan penelitian lebih lanjut.
Terdapat kekurangan literatur mengenai apakah terdapat peningkatan risiko kelainan kromosom pada keturunan pasien TS, sehingga penilaian risiko ini belum dapat diandalkan. Meskipun pasien TS telah diberitahu secara rinci, baik secara lisan maupun tertulis, mengenai akses mereka yang terbatas terhadap keturunan dan berbagai risiko yang diketahui dan tidak diketahui dari kehamilan di masa depan, mudah untuk merekrut gadis-gadis tersebut ke dalam penelitian ini, karena para pasien tampaknya bersedia melakukan apa pun yang mereka bisa selama perawatan kesuburan secara teknis memungkinkan di kemudian hari. Sejak usia 13-14 tahun, pasien-pasien ini sendiri dapat menjadi peserta aktif, sedangkan untuk gadis-gadis yang lebih muda, keputusan akhir harus dibuat oleh orang tua mereka.
Setelah berhasil melakukan fertilisasi in vitro dari folikel-folikel beku, semua wanita dengan TS harus menjalani diagnosis genetik pra-implantasi (PGD), pengambilan sampel vili korionik atau kariotipe amniosentesis selama kehamilan, jika kondisinya memungkinkan. Pengalaman penelitian ini memperkuat keyakinan kami bahwa biopsi dan penyimpanan ovarium pada usia muda pada pasien dengan TS merupakan langkah yang sangat penting dalam pengelolaan infertilitas pada populasi ini.