Dasar-dasar kromosom manusia
Pada tahun 1956, Tjio dan Levan dengan tepat menentukan jumlah kromosom dalam sel manusia menjadi 46, dan barulah studi ilmiah dan sistematis mengenai kromosom manusia dimulai, yang mengarah pada pembentukan sitogenetika manusia. Pada tahun 1959, Lejune menemukan bahwa disgenesis kongenital disebabkan oleh trisomi 21, diikuti oleh sindrom Turner dan sindrom Klinefelter, dan sebuah subdisiplin baru, sitogenetika klinis, dibentuk. Sejak tahun 1970-an, pengembangan teknik pengikatan kromosom ganda telah meningkatkan akurasi analisis kromosom. Pada pertengahan 1980-an, teknik-teknik baru seperti hibridisasi fluoresensi in situ, mikrodiseksi, dan pewarnaan kromosom memungkinkan deteksi langsung perubahan kromosom dan fragmen DNA di dalam nukleus pada tahap interogasi, yang menghubungkan penelitian di tingkat sel dengan eksplorasi di tingkat molekuler, dan menggabungkannya untuk membentuk bidang baru. –Sitogenetika molekuler.
Bagian I. Kromosom manusia
I. Karakteristik dan jenis kromosom manusia
Ciri-ciri morfologi dan struktural kromosom paling khas dari pembelahan sel pertengahan selama siklus sel dan dikenal sebagai kromosom perantara. Setiap kromosom perantara terdiri dari dua kromosom, masing-masing dihelix oleh molekul DNA, dan kedua kromosom tersebut disebut kromatid saudara. Kedua kromosom terhubung satu sama lain oleh sebuah kromosom, yang tidak berinti, bernoda ringan, dan menyempit secara internal, yang disebut penyempitan primer. Struktur khusus di daerah mitosis adalah tempat perlekatan spindel, yang terkait dengan pergerakan kromosom selama pembelahan sel. Mitofagus membagi kromosom secara horizontal menjadi dua lengan, yang lebih panjang disebut lengan panjang (q) dan yang lebih pendek disebut lengan pendek (p). Setiap lengan diakhiri dengan bagian khusus yang disebut telomer, urutan DNA yang sangat berulang, yang diperlukan untuk stabilitas kromosom. Setiap kromosom membutuhkan mitriol dan dua telomer agar stabil. Jika telomer hilang, ujung-ujung kromosom akan kehilangan kestabilannya dan kromosom akan tersambung secara tidak normal, sehingga menghasilkan kromosom yang menyimpang; jika mitosis hilang, kromosom tidak dapat tersambung ke filamen gelendong selama pembelahan sel, yang mengakibatkan penghapusan kromosom. Pada beberapa lengan kromosom, segmen penyempitan bagian dalam yang bernoda ringan yang disebut parakonstriksi juga dapat terlihat. Pada manusia, lengan pendek kromosom proksimal memiliki struktur seperti filamen di sisi distal kromosom yang disebut pengikut, dan struktur seperti filamen antara pengikut dan lengan pendek yang disebut tangkai pengikut, yang sebenarnya juga merupakan zona parakonstriksi, di mana gen RNA ribosom (rRNA) hadir. Produk ekspresinya dikaitkan dengan pembentukan nukleolus dan pemeliharaan struktur serta morfologinya, dan juga dikenal sebagai pengatur nukleolus (NOR). Secara umum ada dua jenis pengikut, di mana diameter pengikut kurang dari 1/2 diameter lengan kromosom disebut pengikut kecil, sedangkan yang lebih besar dari 1/2 diameter disebut pengikut besar. Dalam populasi, polimorfisme terdapat pada panjang parakontrak, ukuran dan jumlah pengikut, dan diwariskan secara Mendel.
Posisi mitosis pada kromosom adalah konstan. Kromosom manusia dibagi menjadi delapan bagian yang sama di sepanjang sumbu longitudinal, dan menurut posisi trofoblas, kromosom manusia dapat dibagi menjadi tiga kategori: (i) kromosom trofoblas submedial, di mana trofoblas terletak di atau di dekat pusat kromosom (1/2 hingga 5/8) dan lengan panjang dan pendek kromosom serupa; (ii) kromosom trofoblas submedial, di mana trofoblas berada sedikit di salah satu ujungnya (5/8 hingga 7/8) dan membagi kromosom menjadi dua lengan yang sangat berbeda; (iii) kromosom trofoblas proksimal (iii) kromosom mitosis proksimal, dengan butiran mitosis di dekat salah satu ujungnya (7/8 ke ujung) (Gambar 6-1 dan 6-2).
II. Kariotipe normal manusia
(i) Sistem Denver Sejak tahun 1956, ketika Tjio dan Leven mengkonfirmasi bahwa jumlah kromosom normal pada sel somatik manusia adalah 46, dan sejak tahun 1959, ketika pertama kali ditemukan bahwa kebodohan bawaan (sindrom Down) disebabkan oleh kromosom ekstra 21 dari biasanya, penelitian tentang kromosom manusia secara bertahap diterapkan pada praktik klinis di seluruh dunia, dan jumlah kelainan kromosom yang ditemukan dan dilaporkan terus meningkat. Untuk memfasilitasi deskripsi kromosom yang menyimpang dalam kasus dan untuk memfasilitasi komunikasi internasional, Konferensi Sitogenetika Internasional Pertama diadakan di Denver, AS, pada tahun 1960 untuk mendiskusikan dan mendefinisikan sistem Denver untuk deskripsi komposisi kromosom intraseluler sebagai dasar untuk mengidentifikasi dan menganalisis kromosom manusia. Sistem Denver adalah dasar untuk identifikasi dan analisis kromosom manusia. Menurut sistem Denver, 46 kromosom dalam sel manusia dibagi menjadi 23 pasang, di mana pasangan 1 hingga 22 umum untuk kedua jenis kelamin, yang disebut autosom, dan diberi nomor 1 hingga 22 secara berurutan; pasangan lainnya terkait dengan jenis kelamin, yang disebut kromosom seks. Dua kromosom seks adalah kromosom XX pada wanita dan kromosom X dan kromosom Y pada pria.
Gambaran semua kromosom dalam sel tubuh disebut kariotipe. Proses mengidentifikasi dan menentukan kariotipe dengan memasangkan dan mengatur semua kromosom sel yang akan diuji menurut sistem Denver disebut analisis kariotipe.
(ii) Identifikasi kariotipe kromosom non-dominan Menurut sistem Denver, 23 pasang kromosom dalam sel somatik dibagi menjadi tujuh kelompok (A hingga G) sesuai dengan ukuran dan karakteristik morfologinya. Pengelompokan kromosom dan karakteristik morfologi masing-masing kelompok ditunjukkan pada Tabel (6-1).
Analisis kariotipe biasanya merupakan proses di mana foto-foto kromosom yang diperoleh dari mikrofotografi diidentifikasi, dianalisis, dan dipotong serta ditempelkan sesuai dengan persyaratan pengelompokan. Menurut sistem internasional, deskripsi kariotipe normal mencakup jumlah total kromosom dan komposisi kromosom seks, yang ditulis sebagai berikut
Kariotipe pria normal 46, XY
Kariotipe perempuan normal 46, XX
(iii) Visualisasi kromosom dan penamaan kromosom
Pada tahun 1968, ahli sitokimia Swedia, Caspersson, memperlakukan spesimen kromosom yang difilmkan secara konvensional dengan pewarna fluoresen quinacrine (QM). Setelah memperlakukan spesimen dengan pewarna fluoresen quinacrine (QM), ditemukan di bawah mikroskop fluoresen bahwa setiap kromosom menunjukkan pita dengan lebar dan corak yang berbeda di sepanjang sumbu panjangnya, dan bahwa masing-masing dari 24 kromosom manusia menunjukkan pola pita yang berbeda, sehingga setiap kromosom dapat diidentifikasi dan dicirikan secara akurat, dan bahkan kelainan struktur kromosom yang kecil pun bisa dideteksi. Hal ini menyebabkan terciptanya teknik Q-banding kromosom, di mana pola pita yang ditampilkan dikenal sebagai Q-banding. Alasan mengapa kromosom menunjukkan pita diperkirakan karena komposisi basa yang berbeda dan tingkat keterikatan heliks molekul DNA yang membentuk kromosom di lokasi yang berbeda. Sejak ditetapkannya teknik Q-band, telah ada sejumlah pita lain seperti G-band, R-band, C-band dan T-band.
C-band dan T-band.
Teknik pita yang umum digunakan.
Spesimen kromosom Q-band diperlakukan dengan pewarna fluoresen seperti quinacrine (QM) untuk memperlihatkan pita. Pita-Q khas dan stabil, tetapi durasi fluoresensi pendek dan spesimen tidak dapat disimpan dalam waktu lama dan harus segera diamati.
G-band adalah jenis pita yang paling banyak digunakan saat ini. Mudah dioperasikan, pola pita jelas, spesimen dapat diawetkan untuk waktu yang lama dan reproduktifitasnya bagus. Metodenya adalah: kromosom diperlakukan dengan reagen seperti tripsin, NaOH, sitrat atau urea, dan kemudian diwarnai dengan pewarna Gimsa, yang menunjukkan pita gelap dan terang secara bergantian, yang disebut G-banding. Yang paling umum digunakan adalah metode perlakuan tripsin. Pola pita yang ditunjukkan oleh setiap nomor kromosom pada dasarnya mirip dengan pola pita Q-band. Pita G yang lebih gelap sesuai dengan pita Q yang lebih terang, sedangkan pita yang lebih terang sesuai dengan pita yang lebih gelap.
Spesimen kromosom R-band diperlakukan dengan buffer fosfat panas dan kemudian diwarnai dengan Gimsa untuk memperlihatkan pita gelap dan terang secara bergantian. Ini juga disebut anti-band karena warnanya berlawanan dengan G-band. Ujung kedua lengan kromosom berpita G dan Q berpita terang, sehingga sulit untuk mendeteksi kelainan struktural seperti penghapusan atau penataan ulang terminal, sedangkan ujung kromosom berpita R berpita gelap, sehingga mudah untuk mengidentifikasi kelainan di area ini, sehingga R-banding terutama digunakan untuk mempelajari penghapusan terminal kromosom dan penataan ulang struktural.
Spesimen kromosom berpita C diperlakukan dengan larutan alkali seperti NaOH atau Ba(OH)2, kemudian ditempatkan dalam larutan natrium sitrat dan natrium klorida, dan kemudian diwarnai dengan pewarna Gimsa, yang menunjukkan pewarnaan spesifik dari daerah mitosis setiap kromosom, oleh karena itu dinamakan pita mitosis, yang juga dikenal sebagai pita-C.
Sebenarnya, C-band menunjukkan wilayah heterokromatin struktural yang berdekatan dengan kromosom, yaitu parakromosom manusia 1, 9, dan 16 di dekat kromosom. Lengan panjang kromosom Y, di sisi lain, berakhir di daerah heterokromatin, yang juga menunjukkan pewarnaan yang signifikan. Oleh karena itu, teknik C-banding digunakan untuk mempelajari perubahan struktural daerah mitosis, kromosom Y, dan daerah parakontraktil.
N-banding Perlakuan spesimen kromosom dengan AgNO3 menghasilkan pewarnaan yang dalam pada parakontraksi, atau daerah pengatur nukleolus (NOR), dari lima pasangan proksimal kromosom mitosis (kromosom 13, 14, 15, 2l dan 22) pada sel manusia, yang disebut dengan N-banding. Sebenarnya, AgNO3 hanya dapat menodai NOR yang aktif secara transkripsi dengan warna hitam, dan NOR positif yang diwarnai perak seperti itu disebut Ag-NOR. NOR yang tidak aktif tidak ternoda. Oleh karena itu, teknik N-banding dapat digunakan untuk mempelajari aktivitas rRNA dan dinamikanya, dan juga untuk mengamati apakah asosiasi pengikut kromosom mitosis proksimal terjadi, karena hal ini merupakan salah satu penyebab tidak terjadinya pemisahan kromosom.
T-banding adalah proses memanaskan spesimen kromosom dan kemudian menodainya dengan pewarna Gimsa, yang dapat menyebabkan pewarnaan dalam yang spesifik pada beberapa segmen ujung kromosom, yang disebut T-banding atau telobanding, yang secara khusus dapat menunjukkan telomer kromosom, dan teknik ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi kelainan kecil pada ujung kromosom.
Metode pita Q, G dan R yang dijelaskan di atas memberikan tampilan konstan dari pola pita spesifik dari 24 kromosom manusia, yang menunjukkan keberadaan objektif dan keaslian pola pita serta memberikan dasar analitis untuk identifikasi perubahan kromosom.
Penerapan teknologi pita lebih lanjut membutuhkan standar terpadu untuk mengidentifikasi dan mendeskripsikan kromosom untuk memfasilitasi komunikasi timbal balik. Berdasarkan rekomendasi dari Konferensi Internasional Keempat tentang Sitogenetika Manusia yang diselenggarakan di Paris pada tahun 1971 dan keputusan yang dibuat pada pertemuan Edinburgh pada tahun 1972, sebuah sistem standar untuk membedakan setiap daerah kromosom dan pita diusulkan dan disebut Sistem Internasional Nomenklatur Sitogenetika Manusia (International System of Human Cytogenetic Nomenclature, ISCN, 1971).
1 dan tanda: wilayah struktural yang berbeda secara morfologis dan stabil pada kromosom, yang merupakan indikator penting untuk identifikasi kromosom pada pita dominan. Ini termasuk ujung kedua lengan kromosom, sarung tangan dan pita tertentu yang konstan dalam kondisi pita yang berbeda.
Wilayah: Area di antara dua penanda batas.
Pita: Setiap kromosom harus dianggap terdiri dari serangkaian pita, yaitu tidak ada daerah yang tidak berpita. Setiap pita dapat dibedakan dari pita-pita yang berdekatan dengan perbedaan intensitas warna yang lebih terang (lebih gelap) atau lebih gelap (lebih terang).
Setiap kromosom dibagi menjadi lengan pendek dan lengan panjang, dengan menggunakan kromosom sebagai penanda batas. Pita-pita pada lengan pendek dan lengan panjang diberi nomor mulai dari mitogen dan diberi nomor sesuai arah mitogen dari dekat ke jauh. Dua zona yang paling dekat dengan filopodia diberi nomor “l” untuk lengan panjang atau “l” untuk lengan pendek, dan “2” dan “3” untuk sisi dekat dan jauh. Penomoran pita di setiap zona mengikuti prinsip yang sama, yaitu pita yang paling dekat dengan filamen di zona tersebut diberi nomor sebagai pita 1 dari zona tersebut, diikuti oleh pita 2 dan 3. Dalam dua kasus, perlu dicatat bahwa pita yang merupakan penanda batas dihitung sebagai pita 1 dari zona yang jauh dari penanda ini; pita yang dibagi menjadi dua oleh filopodia dihitung sebagai pita 1 dari zona tersebut.
Pita yang dibagi menjadi dua oleh butiran perlekatan adalah dua pita yang termasuk dalam lengan panjang dan pendek, dan dicatat sebagai pita 1 zona 1 lengan panjang dan pita 1 zona 1 lengan pendek.
Untuk mendeskripsikan pita tertentu, tuliskan empat elemen: (i) nomor kromosom; (ii) simbol lengan; (iii) nomor zona; dan (iv) nomor pita. Keempat elemen ini ditulis secara berurutan, tanpa spasi atau tanda baca. Sebagai contoh, tanda panah pada Gambar 6-4 menunjukkan kromosom 1, lengan pendek, zona 3, pita 1, ditulis sebagai lp31.
Penerapan teknik pita kromosom memungkinkan identifikasi berbagai kelainan mikrostruktur kromosom, seperti pemutusan, translokasi, dan inversi kromosom, dan untuk memiliki format yang seragam dalam menggambarkan perubahan ini, Sistem Internasional Nomenklatur Sitogenetik Manusia (1978, 1981, 1985), yang disepakati pada pertemuan internasional di Stockholm pada tahun 1997, mengusulkan nomenklatur dan singkatan untuk kromosom dalam pita (Tabel 6-2) untuk aplikasi yang seragam.
3. Aplikasi nomenklatur dan pita kromosom resolusi tinggi Pita G yang umum digunakan untuk menganalisis kromosom pada pertengahan pembelahan sel, saat helisitas kromosom berada pada titik tertinggi sehingga kromosom mengalami kontraksi hingga terpendek, pita cenderung menyatu, dan jumlah pita yang ditampilkan rendah. Biasanya haplokromosom fase pertengahan hanya menunjukkan 320 pita. Sejak tahun 1975, Yunis dkk. telah mengembangkan teknik pita resolusi tinggi, di mana sel disinkronkan dengan metotreksat dan kemudian diobati dengan kolkisin untuk waktu yang singkat untuk mendapatkan banyak kromosom pada tahap profase dan profase akhir. Ini diikuti dengan pengobatan singkat dengan kolkisin untuk mendapatkan sejumlah kromosom pada tahap pro- dan akhir-tengah, dan kemudian dengan pita untuk mengungkapkan 550-850 pita untuk haplokromosom tahap awal dan menengah dan 850-1.250 pita untuk tahap akhir. Pita-pita ini semua disebabkan oleh helisitas yang relatif rendah dari kromosom yang memanjang dan perpaduan pita-pita pada 320 pita terungkap, sehingga sangat meningkatkan tingkat studi kromosom. Apa yang sebelumnya dianggap sebagai “penyakit monogenik” dan sindrom yang mereka tunjukkan karena tidak ada kelainan yang teramati pada kromosom, pada kenyataannya disebabkan oleh perubahan kecil pada kromosom. Sebagai contoh, sindrom WAGR, yang dianggap sebagai kelainan genetik AD, disebabkan oleh penghapusan fragmen llpl4.1-p13; Sindrom Prader-Willi, yang juga dianggap sebagai kelainan genetik AD, sebenarnya disebabkan oleh penghapusan dan penataan ulang 15q11.2. Sebagai contoh, penyebab disgenesis kongenital pertama kali diidentifikasi oleh Weune (1959) sebagai akibat dari kromosom ekstra 2l. Dengan menggunakan teknik pita resolusi tinggi, lebih lanjut ditentukan bahwa gejala utama disgenesis kongenital hanya terkait dengan duplikasi fragmen kecil 21q22.3. Penerapan teknik pita resolusi tinggi untuk mempelajari struktur mikro kromosom dan efek genetik dari perubahan struktural juga dikenal sebagai mikrositogenetika. Sekarang dimungkinkan untuk menunjukkan antara 3.000 dan 10.000 pita pada kromosom di Gz atau profase awal, yang mendekati jumlah gen struktural yang ada di dalam sel (sekitar 30.000), sehingga mengurangi jarak antara sitogenetika dan genetika molekuler.
Nomenklatur kromosom resolusi tinggi menunjukkan bahwa satu pita tunggal pada tingkat 320 pita biasanya dapat dibagi menjadi beberapa pita – subpita – dalam kromosom resolusi tinggi. Berkenaan dengan nomenklatur dan representasi subband, ISCN (1981) menyatakan bahwa subband dari salah satu pita yang dinamai dalam ISCN (1978) mempertahankan zona asli dan nomor pita penanda batasnya, dan setiap pita dibagi lagi dengan menambahkan titik setelah nomor pita asli dan menulis nomor setiap subband, dengan prinsip penomoran yang masih berurutan dari ujung mitosis ke ujung lengan. Sebagai contoh, pita lp3l asli dibagi menjadi tiga subpita, yang harus ditulis sebagai lp31.1, 1p31.2 dan 1p31.3.
Dari jumlah tersebut, lp31.1 dekat dengan mitofagus dan 1p31.3 jauh dari mitofagus. Jika sub-band dibagi lagi menjadi sub-band, nomor sub-band asli dapat diikuti dengan angka, tetapi tidak diperlukan tanda baca lebih lanjut. Sebagai contoh, ketika subband 1p31.3 dibagi menjadi sub-band, maka dituliskan sebagai 1p31.3l, lp31.32 dan lp31.33.
III. Kemajuan dalam penelitian sitogenetika manusia
Singkatnya, teknologi visualisasi kromosom telah memasuki tingkat visualisasi kromosom resolusi tinggi, yang telah sangat meningkatkan kemampuan untuk menganalisis kromosom, tetapi di bawah mikroskop cahaya, ia hanya dapat mengidentifikasi fragmen DNA di atas 4.500 kb, sedangkan kelainan kromosom di bawah 4.500 kb tidak dapat dikenali. Saat ini, penggunaan teknik biologi molekuler telah memungkinkan untuk secara efektif mendeteksi dan menganalisis molekul DNA beberapa puluh hingga 2.000 kb. Oleh karena itu, menggabungkan teknik biologi molekuler dengan mikrokitogenetika sangat bermanfaat dalam analisis penyebab penyakit genetik dan identifikasi gen penyebab penyakit, dan sitogenetika molekuler adalah studi tentang struktur kromosom dan efek genetik penyimpangan pada tingkat molekuler dengan menggunakan metode biologi molekuler, berdasarkan mikrokitologi, dan
Sitogenetika molekuler adalah studi tentang struktur kromosom dan efek genetik dari penyimpangan dan perkembangan penyakit pada tingkat molekuler, berdasarkan mikrositologi. Teknik ini adalah arah perkembangan sitogenetika manusia.
Teknik penelitian utama dalam sitogenetika molekuler adalah sebagai berikut.
1, hibridisasi fluoresensi in situ (hibridisasi fluoresensi in situ,: FISH) Teknik ini dikembangkan berdasarkan teknologi hibridisasi in situ yang didirikan pada tahun 1960-an. FISH memiliki keunggulan karena cepat, aman, ekonomis, sensitif dan spesifik dibandingkan dengan teknik hibridisasi in situ (ISH) pada umumnya. FISH memiliki keunggulan karena cepat, aman, ekonomis, sensitif dan spesifik. Probe dideteksi dengan pewarnaan fluoresen non-radioaktif yang dikombinasikan dengan antibodi atau protein, tidak ada tindakan pencegahan keamanan khusus yang diperlukan, spesimen dapat disimpan untuk waktu yang lama tanpa inaktivasi dan resolusinya dapat mencapai 100-200 kb, sama atau lebih tinggi daripada probe radioaktif. Oleh karena itu, teknik FISH telah banyak digunakan untuk mendeteksi gen eksogen seperti lokalisasi gen, penyimpangan kromosom, amplifikasi gen, dan virus yang diintegrasikan ke dalam sel manusia. Sebagai contoh, teknik pita resolusi tinggi telah menunjukkan bahwa penyebab disgenesis kongenital adalah duplikasi fragmen kecil 2lq22.3, yang dapat dipotong dengan menggunakan teknik diseksi mikro untuk mengkloning fragmen DNA yang terkandung di dalamnya dan menggunakan DNA yang dilabeli secara fluoresen sebagai probe untuk melakukan hibridisasi in situ neon pada sel interfase di vili korionik atau cairan ketuban wanita hamil yang berisiko tinggi mengalami disgenesis kongenital, untuk diagnosis pranatal yang cepat untuk disgenesis kongenital. Penggunaan hibridisasi in situ fluoresen pada sel janin interstisial dalam vili korionik atau cairan ketuban wanita hamil dimungkinkan. Teknik FISH beraneka warna ini telah berkembang pesat dalam beberapa tahun terakhir dan telah menjadi alat penting untuk lokalisasi gen dan diagnosis penyakit genetik.
2, hibridisasi in situ fluoresensi serat DNA (serat DNA-FISH) Teknik ini adalah teknologi pemetaan genom resolusi tinggi visual yang baru didirikan, poin utama dari teknologi ini adalah untuk pertama-tama memperlakukan sel yang akan diuji dengan larutan alkali atau larutan formaldehida, sehingga organisasi kromatin nuklir interfase kromatin longgar (filamen) dari kerangka nuklir, untuk mempersiapkan serat DNA pada slide, dan kemudian warna yang berbeda Serat DNA-FISH adalah prosedur yang sama dengan analisis FISH untuk mendeteksi kelainan kromosom, tetapi yang pertama memiliki keunggulan resolusi yang lebih tinggi (1 hingga 500 kb) dan panjang probe dalam kisaran 1 hingga 300 kb. Kisaran 300 kb. Oleh karena itu, teknologi DNA fiber-FISH banyak digunakan dalam pemetaan genom manusia, analisis struktur kromosom dan analisis penyakit kromosom, tumor, dan penyakit monogenik tertentu.
Pelapisan kromosom Pelapisan kromosom adalah kombinasi teknik FISH dan Chromosome In Situ Suppression Hybridisation (CISS), di mana DNA untai tunggal dan Cot-1 digunakan untuk menutup sekuens genom yang berulang-ulang guna mengurangi sinyal hibridisasi non-spesifik dan dengan demikian meningkatkan hibridisasi spesifik, dan pustaka DNA spesifik kromosom digunakan sebagai kumpulan probe untuk melapisi seluruh kromosom atau wilayah spesifik kromosom dengan fluoresensi yang berbeda.
Langkah dasar dalam teknik pelapisan kromosom adalah pelabelan DNA spesifik kromosom (kromosom utuh atau daerah spesifik kromosom) dengan zat non-isotop, misalnya biotin, yang disiapkan sebagai probe DNA dan kemudian dihibridisasi secara in situ dengan kromosom sel target, yang kemudian dideteksi dan diamplifikasi dengan reaksi antigen-antibodi dengan protein anti-biotin streptavidin dengan zat berpendar. Seluruh kromosom atau segmen kromosom yang akan diuji kemudian dapat menampilkan sinyal hibridisasi fluoresen, sehingga diagnosis dapat dibuat. Misalnya, untuk menganalisis translokasi mikroskopis yang melibatkan dua kromosom, digoxigenin-1l-duTp dan biotin umum dapat digunakan untuk memberi label pada dua kromosom secara terpisah, membuat dua probe DNA yang berbeda, yang dapat dihibridisasi dan kemudian dideteksi serta diperkuat oleh reaksi antigen-antibodi, sehingga dua kromosom dalam kariotipe yang sama dapat diberi warna yang berbeda (mis. Satu merah dan yang lainnya hijau), sedangkan translokasi timbal balik membentuk Dua kromosom turunan, masing-masing dengan warna merah dan hijau, dapat diidentifikasi dengan jelas. Hal ini menunjukkan bahwa teknik baru ini akan memiliki berbagai aplikasi dan nilai penting untuk analisis translokasi kompleks kromosom manusia, sitogenetika tumor, dan lokalisasi gen.
4. Hibridisasi genom komparatif (CGH) Kallioniemi (1992) dan Manoir (1993) membuat teknik CGH berdasarkan teknik FISH, yang didasarkan pada pelabelan DNA genom tumor (DNA yang akan diuji) dan DNA kontrol normal dengan penanda non-isotopik yang berbeda, dan kemudian mencampurkan keduanya dengan rasio 1:1 untuk membuat probe. Probe kemudian dicampur dalam rasio 1:1 dan dihibridisasi secara in situ dengan kromosom darah tepi normal untuk penghambatan, dan probe diuji dengan pewarna fluoresen yang berbeda. DNA tumor biasanya diberi label berwarna hijau dan DNA genom normal berwarna merah. Jumlah relatif DNA tumor yang dihibridisasi ke daerah kromosom dan DNA kontrol normal tergantung pada kandungan urutan ini dalam dua sampel, yang dapat ditentukan dengan pengamatan visual terhadap perbedaan antara dua warna di daerah kromosom yang berbeda untuk menentukan jumlah salinan relatif dari dua sumber DNA yang berbeda, atau dengan mengukur rasio fluoresensi merah terhadap hijau menggunakan mikroskop fluoresen yang terhubung ke sistem analisis gambar berwarna yang terkomputerisasi. Hal ini juga dapat digunakan untuk mengukur rasio fluoresensi merah ke hijau menggunakan mikroskop fluoresen yang terhubung ke sistem analisis gambar berwarna terkomputerisasi. Teknik baru ini memungkinkan deteksi dan lokalisasi salinan urutan DNA di antara genom yang berbeda pada tingkat semua kromosom atau sub-pita kromosom, serta identifikasi asal-usul komponen tertentu dari kromosom tumor (misalnya mikrosom ganda, kromosom penanda) yang sulit ditentukan dengan menggunakan teknik sitogenetik, dan juga menyediakan deteksi cepat informasi tentang trisomi kromosom, monosomi, atau perubahan jumlah salinan segmen kromosom yang lebih besar, sehingga memudahkan diagnosis Ini juga memberikan informasi tentang variasi nomor salinan trisomi, haplotipik atau fragmen besar, sehingga memfasilitasi diagnosis cepat kondisi seperti kebodohan bawaan dan aborsi spontan.